目的:本实验旨在探索一种改良的,能快速获取高纯度雪旺细胞培养的方法,并评价利用改良后方法培养的雪旺细胞联合神经干细胞及Laminin-chitosan-PLGA导管修复受损大鼠喉返神经的效果。方法:采用改良后的胶原酶和中性酶复合消化法消化3-5d的大鼠坐骨神经,以获取原代雪旺细胞。再将制备好的新型Laminin-chitosan-PLGA神经导管联合雪旺细胞和神经干细胞、结合显微外科缝合技术来修复5mm长大鼠喉返神经缺损。术后8周及12周分进行组织学和功能学等方面的检查,并与导管+雪旺细胞组、导管+神经干细胞组、单纯导管组、自体神经移植组、假手术组对比。结果:1.通过胶原酶和中性酶复合酶消化法可快速获取高纯度的雪旺细胞,传代培养至第二代后,细胞纯度在98%以上,此方法优于传统的雪旺细胞培养法;2.术后12周神经电生理以及神经营养因子的分泌方面共培养组的结果优于自体神经移植组,而在术后再生髓鞘数目方面,自体神经移植组效果更佳;共培养组与自体神经移植组再生髓鞘面积无明显差异。结论:将体外构建的新型Laminin-chitosan-PLGA神经导管联合神经干细胞及雪旺细胞移植到大鼠喉返神经损伤处,能够促进大鼠喉返神经的修复。第一章一种改良的大鼠雪旺细胞体外培养的实验研究目的:本实验旨在探索一种改良的雪旺细胞培养的方法,以获取大量、高纯度的雪旺细胞,并对培养的细胞进行免疫荧光鉴定。方法:采用改良后的胶原酶和中性酶复合消化法消化3-5d的大鼠坐骨神经,以获取原代雪旺细胞,然后使用中性酶纯化传代,并与传统雪旺细胞培养方法进行比较,最后使用S-100对培养的细胞进行免疫荧光鉴定。结果:1.通过胶原酶和中性酶复合酶消化法可快速获取高纯度的雪旺细胞,传代培养至第二代后,细胞纯度在98%以上,此方法优于传统的雪旺细胞培养法;2.培养细胞的免疫荧光鉴定显示S-100特异性标志物染色呈阳性。结论:改良后的复合酶消化法可以获取高纯度的雪旺细胞,此方法优于传统的雪旺细胞培养法。第二章Laminin-chitosan-PLGA神经导管联合神经干细胞及雪旺细胞修复大鼠受损喉返神经的实验研究目的:本实验旨在评价Laminin-chitosan-PLGA复合导管联合雪旺细胞及神经干细胞修复受损大鼠喉返神经的效果。方法:取150g雌性SD大鼠120只,随机分为6组,分别为:Laminin-chitosan-PLGA神经导管+雪旺细胞+神经干细胞组(共培养组);Laminin-chitosan-PLGA神经导管+雪旺细胞组(雪旺细胞组);Laminin-chitosan-PLGA神经导管+神经干细胞组(神经干细胞组);单纯Laminin-chitosan-PLGA复合导管组(空导管组);自体神经移植组;假手术组。利用制备的新型Laminin-chitosan-PLGA神经导管联合雪旺细胞和神经干细胞、结合显微外科缝合技术来修复5mm长大鼠喉返神经缺损。术后8周及12周分进行组织学和功能学等方面的检查。结果:术后12周时,CO组透射电镜下可观察到生长较好的髓鞘,其髓鞘厚度和直径大于AUTOGRAFT组,髓鞘的面积方面两者无明显统计学差异;甲苯胺蓝染色下进行髓鞘计数,AUTOGRAFT组数目较CO组更多,肌电图检测显示:CO组潜伏期及波幅的恢复均优于AUTOGRAFT组。Real-time q PCR:CO组喉肌和再生神经中BDNF和GDNF的表达都高于其他各组。喉镜下表现:12周时CO组基本恢复杓状软骨外展功能,声门基本闭合,与AUTOGRAFT组相似,且明显好于除SHAM组以外的其他各组。结论:体外构建复合Laminin-chitosan-PLGA神经导管联合神经干细胞及雪旺细胞到大鼠喉返神经损伤处,能够促进大鼠喉返神经的修复。