雌激素作为主要的性激素在女性机体的各个部位包括神经系统产生多种生理作用。在体的实验结果已确定雌激素具有神经保护作用，能抑制神经元的退行性改变。离体实验也证实在氧应激、兴奋毒性及β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）引起的损伤中雌激素能增加神经元的存活，起神经保护作用。流行病学的研究结果也认为绝经后妇女用雌激素替代治疗能降低阿尔茨海默病的患病风险。此外，有证据提示雌激素能减少帕金森病的发病。但是，绝经后妇女激素替代治疗的使用近年来受到争议，部分原因是认为它有可能增加罹患乳腺癌和子宫癌的风险。因此，设计和寻找理想的雌激素类似物（具有有效的保护作用，同时对生殖系统的副作用相对较小）作为更安全的激素替代治疗用药，将是较好的选择。雷洛昔芬（raloxifene）作为一种选择性的雌激素受体调节剂，是一种人工合成的非类固醇苯并噻吩衍生物，具有一定的组织特异性。在生殖系统组织中，raloxifene表现为雌激素拮抗剂的作用，能抑制乳腺和子宫肿瘤的生长。而在生殖系统以外的组织中，raloxifene表现为部分雌激素激动剂的作用，能够防止骨钙流失和降低血清胆固醇水平。有证据显示，raloxifene在中枢神经系统的多巴胺受体上具有雌激素激动剂的活性。此外，raloxifene在氧应激和β淀粉样蛋白引起的神经损伤中能起保护作用。这种组织选择性拮抗剂／激动剂的特点使它有可能成为一种激素替代治疗的理想药物。但对raloxifene的神经保护作用的细胞和分子机制我们目前还知之甚少。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中主要的兴奋性氨基酸神经递质。它的受体，特别是N-methyl-D-aspartate（NMDA）受体在突触可塑性中扮演了重要角色。突触的可塑性是学习和记忆的基础。但谷氨酸受体的过度激活使细胞内游离钙离子浓度增高，引起钙超载。钙超载会启动一系列的细胞反应，包括氧自由基的产生，线粒体膜的去极化和蛋白酶的激活，最后导致细胞凋亡和坏死。这就是谷氨酸的兴奋毒性损伤。兴奋毒性引起的细胞死亡发生在多种神经系统疾病中，包括中风、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）和Huntington舞蹈病（Huntington’s disease，HD）等。不仅谷氨酸的兴奋毒性损伤与钙的超载有关，其他多种因素包括氧应激、β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）等引起的神经损伤都与钙稳态的失衡有关。在本实验中，我们在原代培养的大鼠海马和皮层神经元中观察了雌激素和raloxifene对谷氨酸引起的细胞内钙增加的作用，并对其细胞机制做了初步的探讨。用激光共聚焦显微镜检测fluo3荧光标记的神经元细胞内钙浓度；用MTT法检测神经元细胞活性。用全细胞膜片钳记录钙电流。第一部分：雌激素对培养的大鼠海马神经元的保护作用1．在培养的大鼠海马神经元中雌激素对谷氨酸诱导的细胞内钙增加的影响1．1 17β-雌二醇对谷氨酸诱导的细胞内钙增加的影响实验在室温条件下进行：首先用无镁-BSS灌流细胞1min；接着灌流液中加入谷氨酸（终浓度300μmol／L）灌流1min，细胞内钙离子浓度明显升高；再用无镁-BSS冲洗2.5分钟；使细胞内钙浓度恢复，随后用17β-estrsdiol灌流预孵3min；再（第二次）给予相同浓度的谷氨酸1min。17β-estradiol(5×10^-5mol／L)可使谷氨酸引起的细胞内钙升高的幅度明显降低，比单独给予谷氨酸引起的钙离子浓度升高幅度低43.2±2.1％。17β-estradiol的效应与浓度呈正相关，IC₅₀值为1.8μmol／L。17β-estrsdiol对谷氨酸引起细胞内钙增加的减弱作用可被冲洗掉。1．2不透膜的雌二醇β-estradiol-6-（O-carboxymethyl）oxime：BSA（E2-BSA）对谷氨酸引起的细胞内钙增加的影响E2-BSA由于耦联了BSA，成为大分子的水溶性物质，不能透过细胞膜，因此被用来观察17β-estradiol是否作用于细胞膜表面的受体或结合位点，通过非基因的途径而产生作用。用5×10^-5mol／L浓度的E2-BSA预孵3min，谷氨酸引起的细胞内钙升高的幅度仍比单独给予谷氨酸引起的钙离子浓度升高幅度低42.9±6.1％，与相同浓度17β-estradiol的作用强度相当。1．3雌激素受体拮抗剂对17β-雌二醇和E2-BSA的抑制作用的影响雌激素受体的特异性拮抗剂ICI 182，780(10^-6mol／L)能阻断17β-estrsdiol和E2-BSA对谷氨酸诱导的细胞内钙升高的减弱作用。2．雌激素对β淀粉样蛋白引起的大鼠海马神经元细胞损伤的影响用MTT法检测培养的神经元的细胞活性，根据所测的光密度值（OD）判断细胞的活性。10^-5mol／L Aβ_{（25～35）}处理神经元24h后，MTT法检测到细胞OD值（活性）比对照组降低14.8±8.1％，17β-estradiol(10^-7mol／L)预处理72小时后，能够明显减弱（7.4±6.6％）Aβ_{（25～35）}引起的神经元细胞活性降低的幅度。10^-6mol／L浓度的17β-estradiol也有相似作用。雌激素受体的特异性拮抗剂ICI 182，780能有效地阻断该效应。但不透膜的雌激素E2-BSA没有相似的作用。第二部分Raloxifene对培养的大鼠皮层神经元细胞内钙增加及钙电流的影响1．较低浓度(10^-7～10^-5mol／L)raloxifene对大鼠皮层神经元细胞内钙浓度及电压依赖性钙电流的影响1．1 Raloxifene对大鼠皮层神经元细胞内钙浓度的影响用10^-5mol／L的raloxifene预孵3min后，谷氨酸引起的细胞内钙升高的幅度比单独给予谷氨酸引起的钙离子浓度升高幅度低35.0±3.4％。这一效应与raloxifene的浓度(10^-6～10^-5mol／L)呈正相关。给予raloxifene后，再用无镁-BSS充分冲洗后，谷氨酸引起细胞内钙增加的作用与单独给谷氨酸引起的钙离子浓度升高幅度相似，表明raloxifene的作用在冲洗后不再出现。为了探讨raloxifene的作用是否通过雌激素受体介导，实验中用雌激素受体特异性的抑制剂ICI 182，780观察能否阻断raloxifene的作用。结果表明，ICI 182，780(10^-6mol／L)不能阻断raloxifene的作用。毒胡萝卜素（thapsigargin，TG）是细胞内质网钙泵的抑制剂，thapsigargin作用于细胞一定时间后，内质网钙库中的钙将耗竭，此时内质网的钙不能再释放，因而被广泛地应用。观察结果，给予thapsigargin(10^-6mol／L)后raloxifene减弱谷氨酸引起的细胞内钙增加的作用仍然存在。1．2 Raloxifene对大鼠皮层神经元电压依赖性钙电流的影响在全细胞记录的膜片钳实验中观察到，10^-5mol／L raloxifene灌流细胞5min后，高电压激活的钙电流幅度明显降低，比给予raloxifene前低50.97±9.51％2．较高浓度(2×10^-5～7.5×10^-5mol／L)raloxifene对大鼠皮层神经元细胞内钙浓度的影响在培养的皮层神经元细胞内钙处于静息状态时，高浓度(2.5×10^-5～7.5×10^-5mol／L)的raloxifene可快速使细胞内钙离子浓度的水平降低；随着raloxifene浓度的增加，该作用效应继续增强，效应与浓度呈正相关。充分冲洗（7min）后，细胞内静息钙水平恢复到原来水平。综上所述，可得出以下结论：1．17β-雌二醇能快速减弱谷氨酸诱导的细胞内钙浓度增高。这种作用可不依赖于细胞内的雌激素受体，而可能通过膜上的雌激素受体介导。2．17β-雌二醇作用72小时后，能抑制Aβ引起的神经元细胞活性的降低。这种效应依赖于细胞内的雌激素受体，可能主要通过基因转录途径实现。3．Raloxifene能减弱谷氨酸诱导的细胞内钙增高。这种作用是快速的，非基因介导的，而且不依赖于ICI 182，780敏感的雌激素受体。Raloxifene的这种作用可能与它抑制高电压依赖的钙通道开放有关。4．Raloxifene在高浓度时不仅抑制谷氨酸引起的细胞内钙浓度增高，而且可使培养的神经元细胞内钙离子浓度的静息水平降低，该作用可能是通过细胞膜的非基因机制介导的。