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目的:
内分泌治疗在乳腺癌的综合治疗中占有重要地位,它是通过降低和清除体内雌激素水平,阻止肿瘤的生长繁殖,达到抗肿瘤作用。但多药耐药(multidrugresistance,MDR)的出现给乳腺癌的内分泌治疗带来了困难。以往研究表明,肿瘤耐药的机制复杂,包括多个耐药基因的表达,肿瘤细胞自己合成生长因子或对生长因子发生反应,细胞凋亡调节基因的突变导致细胞凋亡功能的异常,PKC的活性异常等。本文旨在研究PKC在乳腺癌细胞凋亡中所起的作用及与MDR的关系。
实验方法:
(1)用Western Blot和RT-PCR检测乳腺癌敏感型细胞株MCF-7和耐药型细胞株MCF-7/ADR在PKCα、PKCδ、ER和p-gp以及耐药基因mdrl表达的差异。
(2)用MTT方法检测tamoxifen(TAM)对两个细胞株细胞活性的影响；台盼蓝拒染法检测TAM对两个细胞株细胞死亡率的影响；进一步用DNAladder方法证实TAM引起的细胞死亡是凋亡,用FACS检测tamoxifen引起细胞凋亡的凋亡率的差异；最后用Western Blot的方法研究TAM作用于细胞时PKCα、PKCδ、ERK和JNK磷酸化水平的变化。
(3)用FACS和台盼蓝拒染法检测加入PKCα和JNK抑制剂以后两个细胞株的凋亡变化,并用Western Blot的方法检测了在这个变化过程中PKCα和JNK的磷酸化变化及通过RT-PCR的方法检测PKCα抑制剂对mdrl的影响。
结果:
(1)用Western blot方法检测两个细胞株在PKCα和PKCδ表达存在着相反的现象,MCF-7高表达PKCδ,其含量是MCF-7/ADR的三倍以上；而在MCF-7/ADR,则非常强烈的表达PKCα,是MCF-7细胞的7倍以上；用该方法检测到p-gp在MCF-7/ADR中表达而在MCF-7细胞中不表达；ER的表达情况和p-gp相反。
用RT-PCR的方法检测两个细胞株中耐药基因mdrl的表达:MCF-7细胞不表达mdrl,而MCF-7/ADR细胞表达mdrl。
(2)用MTT方法检测TAM对细胞活性的影响,发现5-30μM TAM使MCF-7细胞的活性由85.99％±0.69％降低到19.62％±3.35％,而对MCF-7/ADR细胞仅仅是由96.04％±0.36％降低到62.28％±4.21％。台盼蓝拒染实验发现TAM明显引起了MCF-7的细胞死亡,30μM TAM在12h可以引起细胞的全部死亡,而10μM TAM作用24h引起了一半细胞的死亡；而在MCF-7/ADR只有当TAM浓度提高到25μM时才可以看到明显的细胞死亡,30μM TAM作用24h引起35.23％±1.98％的细胞死亡；用DNAladder方法研究发现MCF-7细胞中DNA阶梯的出现呈现时间依赖关系,而MCF-7/ADR细胞除了H2O2阳性对照组出现DNA阶梯,其他各组均没有阶梯出现。用FACS方法研究发现两个细胞株凋亡率存在着明显的差异,10μM TAM引起的凋亡率分别是49.82％±4.14％和14.52％±4.32％；20μM TAM引起的凋亡率是69.10％±2.09％和22.90％±3.58％；而30μM TAM引起的凋亡率分别是81.08％±4.67％和33.25％±2.10％。
(3)用Western Blot方法研究发现10μM TAM作用1h-24h引起了MCF-7细胞PKCα磷酸化水平的增高,呈时间依赖性,而MCF-7/ADR处于饱和状态。同时TAM激活了MCF-7 PKCδ磷酸化,也呈时间依赖性；MCF-7/ADR呈微弱表达。TAM引起的ERK的磷酸化变化:在MCF-7细胞中,ERK的磷酸化水平渐增强,6h达最高,在12h又有所降低,24h又升高；而在MCF-7/ADR中,TAM对ERK无激活作用;TAM引起了MCF-7细胞的/NK磷酸化呈时间和浓度依赖性,而在MCF-7/ADR仅仅引起细胞JNK微弱的磷酸化。
(4)PKCα抑制剂G(o)6976能增强TAM引起的细胞株凋亡和MAPK磷酸化水平:台盼蓝拒染法和FACS检测在G(o)6976存在的情况下TAM对细胞凋亡的影响,发现G(o)6976可以提高TAM引起的细胞凋亡,在MCF-7/ADR中,与10μM、20μM和30μM TAM单独处理组比较提升率分别达到19.1％、21.O％和17.9％；同时它单独或和TAM联合作用都能够提高JNK的磷酸化水平。JNK的抑制剂sp600125抑制了MCF-7的凋亡,并且它仅仅能够抑制JNK的磷酸化水平,对ERK、PKCα磷酸化水平没有影响。联合应用PKCα和JNK的抑制剂结果显示:JNK的抑制剂sp600125能逆转G(o)6976的作用,表现为细胞凋亡率降低,JNK不能被磷酸化。
(5)G(o)6976对耐药蛋白的影响:Western Blot结果表明,G(o)6976对耐药蛋白p-gp的表达没有影响,RT-PCR结果显示G(o)6976对耐药基因MDRI的mRNA没有影响。
结论:
(1)耐药型细胞株MCF-7/ADR高表PKCα和耐药蛋白p-gp,低表达PKCδ,不表达ER,敏感型细胞株MCF-7则正好相反。
(2)TAM引起MCF-7的细胞死亡是凋亡,其IC50是10μM；而MCF-7/ADR则表现出了对TAM的耐药。在凋亡和耐药这个过程中.()M诱导了MCF-7细胞PKCα和PKCδ高度磷酸化,同时也引起了E()K的磷酸化；在MCF-7/ADR细胞中,PKCα磷酸化过饱和,TAM不能影响其活性；TAM不能激活PKCδ、ERK和JNK。
(3)PKCα抑制剂促进了细胞凋亡,同时使JNK的磷酸化水平增强。JNK的抑制剂抑制了细胞凋亡,并且降低了JNK的磷酸化,对PKCα的磷酸化无影响,但可以逆转PKCα抑制剂的作用；G(o)6976对耐药蛋白p-gp和耐药基因mdrl都没有影响。PKCα通过对其下游JNK的控制而导致了细胞对TAM的耐药。