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背景胰腺癌是消化系统中恶性程度较高、预后极差的肿瘤,其发生发展机制尚未阐明。实现早期诊断与增强化疗效果,是胰腺癌诊治过程中的重点与难点。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是第一个用于胰腺癌化疗的药物,目前仍然广泛应用、具有一定疗效,5-FU耐药性是限制该药应用的主要困扰。国内外多项对5-FU敏感/耐药的胰腺癌或其他肿瘤细胞株的基因芯片与蛋白质组学筛查,获得了一些差异蛋白,但是重合率并不好,可能与基因芯片探针数及二维凝胶电泳所导致的检测通量不足有关。在早期诊断方面,本实验室前期工作发现了9个胰腺癌免疫相关原性膜抗原,同时已对儿茶酚胺氧位甲基转移酶(Catechol-O-Methyltransferase,COMT)、抗增殖蛋白(prohibitin,PHB)、电压依赖离子通道(Voltage-Dependent Anionchannel, VDAC1)进行了一定程度的生物功能研究与标志物有效性验证,Stomatin样蛋白2(stomatin like protein2, SLP-2,Stoml2)等其他候选蛋白的研究还有待继续深入。目的1.验证人胰腺癌细胞系亲本株PaTu8988/-与5-FU耐药株PaTu8988/FU对5-FU的药物敏感性差异。2.筛查亲本株PaTu8988/-与耐药株PaTu8988/FU的差异表达基因及蛋白。3.研究SLP-2蛋白在人胰腺癌细胞系中的生物学功能。4.完善prohibitin蛋白过表达后所发生的细胞功能改变的研究。材料与方法1.应用CCK-8法检测人胰腺癌细胞系亲本株PaTu8988/-与5-FU耐药株PaTu8988/FU对5-FU的IC50差异。2.应用Annexin V/PI双染法分析亲本株PaTu8988/-与耐药株PaTu8988/FU在5-FU诱导下发生细胞凋亡的差异。3.应用Affymetrix人全转录组外显子芯片GeneChip(?) Exon1.0ST Array筛查亲本株PaTu8988/-与耐药株PaTu8988/FU的基因表达差异。4.应用同位素标记相对和绝对定量技术(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)结合TripleTOFTM5600高分辨液相色谱质谱联用系统筛查亲本株PaTu8988/-与耐药株PaTu8988/FU的蛋白表达差异。5.应用qPCR及Western blotting法检测SLP-2在9株人胰腺癌细胞系(Capan-1、Panc-1、MIAPaCa-2、T3M4、AsPC-1、BxPC-3、PaTu8988、Su86.86、 SW1990)中的表达水平。6.构建pIERS2-EGFP(+)-SLP2过表达系统与SLP-2siRNA抑制系统,分别瞬时过表达或抑制SLP-2蛋白在细胞系MIAPaCa-2与BxPC-3中的表达水平。应用CCK-8法、Transwell法观察并对比干预前后胰腺癌细胞在增殖、迁移与侵袭能力的变化。7.应用qPCR及Western blotting法检测prohibitin在9株人胰腺癌细胞系(Capan-1、Panc-1、MIAPaCa-2、T3M4、AsPC-1、BxPC-3、PaTu8988、Su86.86、 SW1990)中的表达水平。8.构建pIERS2-EGFP(+)-prohibitin过表达系统,瞬时过表达prohibitin蛋白在细胞系MIAPaCa-2中的表达水平。应用CCK-8法、Transwell法观察并对比干预前后胰腺癌细胞在增殖、迁移与侵袭能力的变化。结果1. CCK-8法耐药敏感性检测测定两株细胞50%抑制浓度IC50, PaTu8988/-IC50=4.49±0.60μg/ml, PaTu8988/Fu IC50=79.19±21.55μg/ml,具有显著性差异(p=0.0002),耐药系数RI=17.64。2.细胞凋亡分析(Annexin V/PI双染法)提示,在5-FU作用下,亲本株PaTu8988/-较耐药株PaTu8988/Fu更易出现细胞凋亡现象。2500μg/ml5-FU作用下,亲本株PaTu8988/-凋亡率可达45.47±2.14%,而耐药株PaTu8988/Fu凋亡率只有22.33±2.21%。3.转录组外显子芯片筛查,发现亲本株PaTu8988/-与5-FU耐药株PaTu8988/FU差异表达mRNA2052条,其中PaTu8988/FU较PaTu8988/-上调(>2.0)1828条,下调(<0.5)224条。4.蛋白质组学筛查,发现亲本株PaTu8988/-与5-FU耐药株PaTu8988/FU差异表达蛋白353个,其中PaTu8988/FU较PaTu8988/-上调(>1.5)259个,下调(<0.7)94个。5.基因芯片筛查与差异蛋白质组学筛查共同筛出PaTu8988/FU较PaTu8988/-差异蛋白69个,上调蛋白ABCD3、MTHFD1L、TP53I3、POLA1、SRGAP1、C5等54个,下调蛋白EPCAM、MCAM等15个。6. slp-2蛋白在9株人胰腺癌细胞系中均有明确表达,但表达量各有差异。结合qPCR与Western blotting结果在MIAPaCa-2中表达量较低,在BxPC-3中表达量较高,BxPC-3细胞系SLP-2表达量是MIAPaCa-2的3倍(p<0.005)。7.在体外水平,PIERS2-EGFP(+)-SLP2过表达质粒转染72小时后,SLP-2蛋白表量可趋近高值,过表达组较对照组SLP-2蛋白表达量调高至近3倍(p<0.05),过表达组增殖、迁移、侵袭能力明显提高(p<0.005, p=0.0001, p <0.0001); SLP-2siRNA转染48小时后,SLP-2蛋白表量可趋近低限,抑制组SLP-2蛋白表达量降至对照组的1/2(p<0.05),抑制组细胞增殖、迁移、侵袭能力明显降低(p<0.05,p<0.0001,p=0.0020)。8. Prohibitin蛋白在9株人胰腺癌细胞系中均有明确表达,但表达量各有差异。结合qPCR与Western blotting结果在MIAPaCa-2中表达量较低,在SW1990、AsPC-1、BxPC-3中表达量较高,AsPC-1细胞系prohibitin表达量是MIAPaCa-2的2-3倍(p<0.005)。9.在体外水平,pIERS2-EGFP(+)-prohibitin过表达质粒转染72小时后,prohibitin蛋白表量可趋近高值,过表达组较对照组prohibitin蛋白表达量调高至近1.5倍(p<0.005)。过表达组增殖、迁移、侵袭能力明显提高(p<0.001,p<0.0001,p=0.0005)。结论1.人胰腺癌细胞系亲本株PaTu8988/与5-FU耐药株PaTu8988/FU对5-FU药物敏感性存在差异,后续耐药蛋白筛查实验有意义。2. ABCD3、MTHFD1L、TP53I3、POLA1、SRGAP1、C5等功能蛋白以及EPCAM、MCAM等细胞连接蛋白可能是5-FU的耐药相关蛋白。3.体外实验结果显示,SLP-2蛋白与胰腺癌细胞的增殖及迁移侵袭能力有关。4.体外实验结果显示,prohibitin蛋白与胰腺癌细胞的增殖及迁移侵袭能力有关。