鸡胚注射Fadrozole后性别相关基因的表达研究

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禽类的性别决定以及性腺发育是在多个基因的共同作用下完成的,还受到体内激素水平的影响。目前而言,禽类性别决定机制还不明确。研究表明,Fadrozole能够抑制鸡胚雌激素的合成,促使ZW型鸡胚发育为雄性个体。由于鸡胚的孵化周期短,成本低,因此,性反转鸡胚已成为研究禽类性别相关课题的重要模型。本研究通过对孵化至3.5d的胚蛋气室注射Fadrozole以诱导鸡胚性反转,通过CHD1基因的微量全血PCR确定个体的遗传性别,通过显微镜下观察鸡胚性腺形态变化并对其进行HE染色,通过荧光定量PCR检测性别分化相关基因(DMRT1、SOX9、FOXL2、RSPO1)在E8、E10、E14、E19、1wk(出雏1周龄)鸡(胚)性腺中的表达,通过Western-Blot检测SOX9和RSPO1蛋白在E19鸡胚性腺中的表达,以探索其表达变化。结果如下:
  鸡胚蛋经Fadrozole处理后,ZZ型试验组和对照组个体左右性腺大小相似,均呈棒状,形态结构一致。部分ZW型试验组个体性腺明显雄性化,左侧性腺呈棒状,似睾丸,与ZW型对照组的扁平带有棱角的卵巢特征不同;另有一些ZW型对照组个体右侧性腺并没有萎缩退化,大小和左侧性腺接近。组织切片显示其髓质层出现了ZZ型才有的曲细精管,而皮质层变薄且丢失了ZW型应有的原始卵泡结构。
  在对照组中,DMRT1和SOX9基因在各时期的雄性(ZZ)性腺中有较高表达,而FOXL2和RSPO1在各时期的雌性(ZW)性腺中表达量较高,性别间差异显著(P<0.05);相比于上述性别的高表达,四个基因在心、肾、肝和腿肌中的表达量均较低,但SOX9和FOXL2在脑组织中的表达量仅次于优势表达的性腺。
  经Fadrozole的处理后,四个目的基因在ZZ(雄性)对照组和处理组个体性腺中表达差异均不显著(P>0.05),而在ZW(雌性)性腺的对照组和处理组间表现出显著差异(P<0.05),表明Fadrozole对雌性性腺的效应明显。在ZW处理组性腺中,DMRT1和SOX9两基因的表达量均显著高于ZW对照组(P<0.05),前者随时间逐渐下降,而后者则逐渐增加;在ZW处理组性腺中,FOXL2和RSPO1基因的表达量显著低于ZW对照组(P<0.05),并且随着鸡胚的发育逐渐增加。经Western-Blot检测发现,ZW型处理组个体性腺中SOX9蛋白的表达量明显高于ZW型对照组,而其RSPO1蛋白的表达则明显低于ZW对照组;两蛋白在ZZ型处理组和对照组之间的表达差异不明显。这些结果与上述荧光定量PCR的结果一致。
  综上所述,DMRT1和SOX9基因主要在雄性性腺中表达,而FOXL2和RSPO1基因主要在卵巢中表达。Fadrozole处理3.5d鸡胚后,一些ZW型个体性腺出现了雄性特征,并导致其性腺中DMRT1和SOX9基因表达显著上调以及FOXL2和RSPO1基因表达显著下调,并检测到SOX9和RSPO1蛋白表达水平出现的一致性变化;而ZZ型个体没有明显变化。
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