犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）最初来源于猫泛白细胞减少症细小病毒（Feline Panleukopenia Virus,FPV）,它是猫细小病毒基因突变衍变而来。犬细小和猫细小病毒的基因序列相似度高达99%,但二者具有不同的抗原特性、宿主范围和血细胞凝集特性。自1978年在美国发现犬细小病毒以来,该病毒在全世界快速流行并严重威胁着养犬业的发展。由于病毒变异率高和犬类不及时进行疫苗接种,导致感染动物发病率和死亡率高。目前我国流行的CPV毒株主要为CPV-2a,2b和2c,而当前疫苗株为原始型CPV-2,与流行株免疫学特性相差较大。因此,针对流行毒株研制出安全的预防性疫苗刻不容缓。病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）是由病毒单个或多个结构蛋白自行组装而成的蛋白质复合物,它的形态结构与天然的病毒颗粒相似,但衣壳内不含病毒基因组。VLP疫苗具有类似病毒颗粒的免疫原性,同时具有安全性好的特点。本论文利用昆虫-杆状病毒表达系统获得了大量自组装的犬细小VLP,主要内容如下:1.细小病毒VP2蛋白的表达设计并合成了表达CPV-2a/GS-1毒株VP2蛋白的基因序列、密码子优化后的VP2蛋白基因VP2.opt和FPV VP2蛋白基因。构建了用p6.9和polh串联启动子调控基因表达的载体pQB3a-CPV VP2、pQB3a-CPV VP2.opt、pQB3a-FPV VP2,以T7和p10启动子调控基因表达的载体pTriEx-CPV VP2。琼脂糖凝胶电泳结果表明已成功构建了四种重组表达载体。IPTG诱导表达CPV VP2,发现VP2蛋白可溶性较低,纯化时由于His标签无法暴露出来,导致VP2蛋白纯化困难。将pQB系列质粒与线性化杆粒共转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,利用杆状病毒表达系统表达CPV VP2和FPV VP2。利用终点稀释法和对重组病毒进行病毒滴度测定,按照MOI=3感染High Five细胞和Sf9细胞。对表达产物进行SDS-PAGE分析,可见大小约为64 kDa的VP2蛋白,并且High Five细胞VP2蛋白表达量明显多于Sf9细胞;同时发现vAc-CPV VP2和vAc-FPV VP2重组病毒感染后,VP2表达量高于重组病毒vAc-CPV VP2.opt和vAc-CPV VP2。不同病毒量感染结果发现,vAc-CPV VP2和vAc-FPV VP2以MOI=3感染High Five细胞时蛋白量表达最高。这些结果表明p6.9和polh启动子串联启动表达的VP2产量高,并且密码子未优化的VP2蛋白明显表达量较高。2.CPV VLP的纯化及检测利用蔗糖密度梯度离心纯化CPV VP2形成的VLP,使用透射电镜观察VLP组装情况。试验结果显示,VP2蛋白可被截留在35%-50%蔗糖垫,纯化后的VP2蛋白纯度约为90%;透射电镜显示VP2蛋白可自行组装成形状和大小与天然CPV类似的VLP结构。表明本研究通过昆虫杆状病毒表达系统表达出了自组装的细小病毒VLP。3.VLP的红细胞凝集能力和免疫原性检测血凝检测显示CPV VLP的红细胞凝集平均稀释度为1:2~7。将VLP分两次免疫貉,结果显示,初次免疫诱导产生了特异性抗体,二次免疫后血凝抑制试验检测的抗体水平最高达到1:212。表明本研究制备的CPV VLP具有良好的免疫原性。综上所述,本论文利用昆虫-杆状病毒表达系统,高水平表达了可溶性CPV VP2蛋白,这些蛋白可自发形成与天然犬细小病毒大小形状类似的病毒样颗粒。貉免疫实验显示VP2蛋白形成的VLP具有良好的免疫原性,这为进一步研发CPV的VLP疫苗奠定了基础。