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玉米在幼苗时期最容易感染各种真菌性疾病,其中危害严重的有玉米苗枯病、茎基腐,在河南地区此类病症的优势病原菌是轮枝镰刀菌。MicroRNA(miRNA)是一类内源非编码单链小RNA,长度在20-24 nt之间。在植物中,miRNA通过参与靶基因转录或转录后调节靶基因、植物激素信号调控、生物或非生物胁迫,基因组化学修饰等,对基因的表达起到调节的作用。经过初步的遗传及生理研究筛选,选取玉米自交系BT-1和N6正常生长十天的幼苗为实验材料。其中改良的BT-1是一份综合农艺性状优良、配合力高、抗性较强的玉米自交系,N6则是抗性较弱的玉米自交系。从BT-1和N6自交系幼苗材料中提取RNA,每个自交系各包含两个重复,共构建四个小miRNA文库进行小RNA高通量测序。通过生物信息学的方法分析miRNA在BT-1和N6中的表达水平和差异特性。采用RT-PCR和Northern blot方法对miRNA的测序数据进行验证,同时预测miRNA的靶基因并对靶基因进行功能富集分析和验证,从而进一步筛选抗轮枝镰刀菌相关的microRNA。在4个玉米幼苗miRNA文库N6-1、N6-2、BT-1-1、BT-1-2中,分别得到12286376、16636234、15875945、20294752条高质量的clean reads。对含有两个重复的玉米幼苗自交系N6和BT-1进行表达量筛选,得到的1230个miRNA。在N6中有970个miRNA,其中767个novel miRNA,203个known miRNA;BT-1有1168个miRNA,其中有944个novel miRNA,224个known miRNA。在N6和BT-1中,有908个miRNA共表达,其中196个known miRNA,712个novel miRNA。在N6中特异表达的有90个miRNA,其中7个known miRNA,55个novel miRNA,在BT-1中特异表达的有304个,其中28个known miRNA,232个novel miRNA。总miRNA碱基序列长度分布在18~25 nt范围内,其中在24 nt长度的miRNA最多;对于known miRNA碱基长度分布,长度为21 nt的miRNA最多,而对于novel miRNA碱基长度分布,长度为24 nt的miRNA最多。将miRNA进行归一化得到TPM值,并计算FDR和Log2FC值,筛选后得到差异表达miRNA。对得到的miRNA进行靶基因预测,共797个miRNA预测到了靶基因。预测的总靶基因数目为1453个,并获得相关靶基因的注释信息。差异known miRNA的靶基因主要富集在miR529-5p对应的SBP域及SBP转录因子方面;miR408a和miR408b-3p、miR528a/b-5p和miR397a/b-5p对应的类质体蓝素、铜氧还蛋白及漆酶前体功能方面;以及大部分miR164家族5p对应的NAC、NAM域及转录因子;miR167家族5p对应的结合NABPP的核酸及pumilio家族RNA结合重复子功能方面和大多数miR169家族5p对应的CBF-B/NF-YA转录因子功能方面。差异novel miRNA的靶基因主要富集在脯氨酸富集的亮氨酸锌指拉链转录因子,HPP及TPA潜在同源box和结合磷脂超家族蛋白,潜在含有家族蛋白的DUF1296域,抗衰老相关的DH蛋白,玉米小核核糖核蛋白E,玉米乙烯应答转录因子3,玉米预测类细胞色素,玉米预测pre-mRNA剪切因子SLU7,ARF GTP酶激活域家族蛋白,大米中单肽酶,含重复蛋白的ARM家族蛋白,玉米热激转录因子类蛋白,玉米潜在氨基酸转移酶III超家族蛋白功能方面,主要集中在转录及其加工过程。此外在测序条数大于等于5小于等于10条范围内的低表达量且差异显著的novel miRNA的靶基因主要富集在有数目较多的novel miRNA对应的精氨酸和脯氨酸代谢过程;精氨酸酶家族和尿素水解酶,锰离子结合位点,核糖体蛋白L35保守位点等功能方面。通过Northern blot和RT-PCR方法进行对测序数据的验证,实验结果说明测序数据可信度较高。Northern blot结果表明在N6和BT-1玉米幼苗自交系中确实有测序数据中novel miRNA的成熟体序列存在,RT-PCR的结果显示了有个别的数据需进行实验验证,而测序数据大部分可信。N6和BT-1玉米自交系作为探究两者差异表达miRNA的材料,由此可进一步探究miRNA对轮枝镰刀菌抗性差异模式和机制。用接轮枝镰刀菌的幼苗材料验证抗性差异相关的miRNA及其靶基因。接菌可诱使BT-1中miR397和miR408的表达量增多,而在N6中减少,miR528的表达量在N6和BT-1中均减少;在BT-1中miR397、miR408和miR528的靶基因表达趋势均下降,在N6中它们的靶基因表达趋势则不同。因此结合miR397、miR408和miR528及其靶基因的表达量和趋势,推测miR397、miR408和miR528为潜在抗轮枝镰刀菌的miRNA。对于潜在抗轮枝镰刀菌相关的miRNA进行过表达和CRISPR/Cas9重组载体的构建。目前已获得miR398、miR408、miR528和miR164过表达载体和miR398、miR408、miR528、miR164和miR827的CRISPR/Cas9基因突变载体,分别转化玉米并获得获得miR408、miR528过表达和CRISPR/Cas9的T1代转基因种子。