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研究背景和目的
乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重的全球公共卫生问题，目前全球慢性HBV感染者约有2.4亿例，其中我国有约有8600万例。慢性乙型病毒性肝炎(CHB)、HBV感染相关肝硬化及HBV感染相关肝细胞性肝癌每年可导致全球超过80万人死亡，对社会造成极大的负担。目前用于治疗HBV感染的一线药物核苷(酸)类似物不能清除被感染肝细胞细胞核内的cccDNA，难以实现CHB的临床治愈，新型抗HBV药物亟需研发。柳胺酚是一种核糖核苷酸还原酶(RR)抑制剂，可以抑制细胞内核糖核苷酸(DNA)的生成，从而减少HBV的复制原料。研究发现柳胺酚对HBV复制及cccDNA形成具有强大的抑制作用，但其体内代谢过程仍不明确，生物学转化及代谢过程可能通过改变药物分子结构形成具有更强药理活性或毒性的代谢产物。本文拟对柳胺酚的代谢产物进行鉴定，并对柳胺酚代谢产物抗HBV活性进行分析，进而对活性代谢物抗HBV机制进行研究。
方法
1.通过超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)鉴定柳胺酚在SpragueDawley大鼠的体内药物代谢模型和人肝微粒体的体外药物代谢模型中的代谢产物，使用UNIFI软件对柳胺酚的体内代谢通路进行分析。进一步利用重组人肝脏药物代谢酶筛选系统明确参与柳胺酚代谢过程的肝脏药物代谢酶亚型。
2.使用计算机虚拟分子对接技术计算柳胺酚代谢产物与RRM2活性位点之间的亲和力，筛选具有RRM2抑制活性的代谢物。使用HBV稳定复制细胞模型HepG2.2.15细胞系以及HBV核苷类似物交叉耐药细胞模型HepG2.A64细胞系验证筛选得到的柳胺酚代谢产物对细胞培养基上清中HBVDNA、HBsAg、HBeAg以及细胞内HBVDNA、cccDNA的抑制活性。通过细胞增殖活性实验及细胞凋亡实验明确具有抗HBV活性的柳胺酚代谢物LAF-OH的细胞毒性。进一步通过联合用药实验，使用ComboSyn软件计算LAF-OH与核苷(酸)类似物的联合用药指数。
3.利用蛋白组学筛选LAF-OH作用后表达水平发生改变的差异蛋白并分析差异蛋白参与的生物学过程与抗HBV活性的关系。通过qPCR法、WesternBlot法对差异蛋白表达水平进行验证并分析相关蛋白在mRNA及蛋白质水平表达变化对HBV复制的影响。通过流式细胞术测定LAF-OH对细胞周期比例的调节作用。通过ELISA法分析相关蛋白表达水平变化对RR活性的影响。
结果
1.分别收集SD大鼠经柳胺酚灌胃后在0-3h、3-8h、8-12h及12-24h时间段内的胆汁、粪便、血浆及尿液样本，在0-3h及3-8h收集的胆汁样品中鉴定到6个柳胺酚代谢产物(M1-M6)；在8-12h收集到胆汁样品中鉴定到2个柳胺酚代谢产物(M1、M2)；在0-3h及3-8h收集的粪便样品中鉴定到3个柳胺酚代谢产物(M1、M3和M6)；在其余时间段收集的胆汁、粪便及全部的血浆、尿液样本中未鉴定到柳胺酚的代谢产物。在与人肝微粒体孵育的柳胺酚样本中鉴定到5个柳胺酚代谢产物(M1、M7-M10)。柳胺酚主要的代谢过程包括羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化和代谢性降解等。重组人肝药物代谢酶筛选结果表明CYPIA2与CYP2C9参与了柳胺酚的I相代谢反应；UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9、UGT287与UGT2815参与了柳胺酚的Ⅱ相代谢反应。
2.计算机分子对接拟合结果表明柳胺酚葡萄糖醛酸化代谢产物M8、M10以及柳胺酚羟基化代谢产物LAF-OH与RRM2活性位点的亲和力较柳胺酚更强。基于HepG2.2.15细胞及HepG2.A64细胞的HBV抑制实验发现LAF-OH对HBV的抑制活性较柳胺酚更强且成时间与剂量依赖性，可以显著降低野生型HBV及耐药突变HBV模型细胞培养上清中HBV-DNA、HBsAg以及细胞内HBV-DNA、cccDNA的水平。细胞增殖活性及细胞凋亡实验发现LAF-OH在HepG2.2.15细胞、HepG2.A64细胞、HepG2细胞与HEK293细胞中半数细胞增殖抑制剂量ICso分别为173.4μM、366.7μM、222.3μM与191.8μM，在150μM浓度时未对细胞凋亡造成明显影响。联合药效试验结果表明LAF-OH与拉米夫定、恩替卡韦联合抗HBV具有协同效应；LAF-OH与阿德福韦、替诺福韦联合抗HBV具有相加效应。
3.蛋白组学筛选发现LAF-OH处理后细胞细胞周期、IL-17信号通路及PPAR信号通路相关蛋白表达水平显著降低。WesternBlot分析发现LAF-OH可以通过抑制Akt磷酸化水平降低cyclinD1的表达水平。细胞周期分析结果表明经LAF-OH处理后S期细胞比例明显下降。进一步通过qPCR及WesternBlot分析发现LAF-OH可在不引起RRM2B表达代偿性上调的同时显著抑制RRM2蛋白表达水平下降。RR活性分析发现LAF-OH可通过同时抑制RRM2活性与表达水平的方式显著抑制RR活性。
结论
1.柳胺酚在体内主要通过羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化及代谢性降解等途径代谢。CYP1A2、CYP2C9、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9、UGT287与UGT2815是柳胺酚主要的肝脏代谢酶亚型。
2.LAF-OH与RRM2活性位点具有较高的亲和力，其抗HBV活性较柳胺酚更高。LAF-OH在显著降低细胞培养基上清HBV-DNA、HBsAg与细胞内HBV-DNA、cccDNA水平的同时不产生明显的细胞毒性，具有良好的安全性。此外，LAF-OH对核苷类似物耐药HBV仍具有强大的抑制活性。LAF-OH在与核苷(酸)类似物联合使用时表现出相加效应或协同效应。
3.LAF-OH通过降低Akt磷酸化水平而下调cyclinD1的表达水平，改善因HBV感染造成的细胞周期紊乱，以降低S期细胞比例的方式下调RRM2的表达水平，同时不使RRM2B表达水平代偿性增高。LAF-OH在下调RRM2表达水平的同时与RRM2活性位点竞争性结合，从而大幅抑制RR活性，发挥抗HBV作用。LAF-OH可通过调节IL-17介导的免疫学反应以及PPAR、Akt等信号通路为HBV治疗带来更多潜在获益。
乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重的全球公共卫生问题，目前全球慢性HBV感染者约有2.4亿例，其中我国有约有8600万例。慢性乙型病毒性肝炎(CHB)、HBV感染相关肝硬化及HBV感染相关肝细胞性肝癌每年可导致全球超过80万人死亡，对社会造成极大的负担。目前用于治疗HBV感染的一线药物核苷(酸)类似物不能清除被感染肝细胞细胞核内的cccDNA，难以实现CHB的临床治愈，新型抗HBV药物亟需研发。柳胺酚是一种核糖核苷酸还原酶(RR)抑制剂，可以抑制细胞内核糖核苷酸(DNA)的生成，从而减少HBV的复制原料。研究发现柳胺酚对HBV复制及cccDNA形成具有强大的抑制作用，但其体内代谢过程仍不明确，生物学转化及代谢过程可能通过改变药物分子结构形成具有更强药理活性或毒性的代谢产物。本文拟对柳胺酚的代谢产物进行鉴定，并对柳胺酚代谢产物抗HBV活性进行分析，进而对活性代谢物抗HBV机制进行研究。
方法
1.通过超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)鉴定柳胺酚在SpragueDawley大鼠的体内药物代谢模型和人肝微粒体的体外药物代谢模型中的代谢产物，使用UNIFI软件对柳胺酚的体内代谢通路进行分析。进一步利用重组人肝脏药物代谢酶筛选系统明确参与柳胺酚代谢过程的肝脏药物代谢酶亚型。
2.使用计算机虚拟分子对接技术计算柳胺酚代谢产物与RRM2活性位点之间的亲和力，筛选具有RRM2抑制活性的代谢物。使用HBV稳定复制细胞模型HepG2.2.15细胞系以及HBV核苷类似物交叉耐药细胞模型HepG2.A64细胞系验证筛选得到的柳胺酚代谢产物对细胞培养基上清中HBVDNA、HBsAg、HBeAg以及细胞内HBVDNA、cccDNA的抑制活性。通过细胞增殖活性实验及细胞凋亡实验明确具有抗HBV活性的柳胺酚代谢物LAF-OH的细胞毒性。进一步通过联合用药实验，使用ComboSyn软件计算LAF-OH与核苷(酸)类似物的联合用药指数。
3.利用蛋白组学筛选LAF-OH作用后表达水平发生改变的差异蛋白并分析差异蛋白参与的生物学过程与抗HBV活性的关系。通过qPCR法、WesternBlot法对差异蛋白表达水平进行验证并分析相关蛋白在mRNA及蛋白质水平表达变化对HBV复制的影响。通过流式细胞术测定LAF-OH对细胞周期比例的调节作用。通过ELISA法分析相关蛋白表达水平变化对RR活性的影响。
结果
1.分别收集SD大鼠经柳胺酚灌胃后在0-3h、3-8h、8-12h及12-24h时间段内的胆汁、粪便、血浆及尿液样本，在0-3h及3-8h收集的胆汁样品中鉴定到6个柳胺酚代谢产物(M1-M6)；在8-12h收集到胆汁样品中鉴定到2个柳胺酚代谢产物(M1、M2)；在0-3h及3-8h收集的粪便样品中鉴定到3个柳胺酚代谢产物(M1、M3和M6)；在其余时间段收集的胆汁、粪便及全部的血浆、尿液样本中未鉴定到柳胺酚的代谢产物。在与人肝微粒体孵育的柳胺酚样本中鉴定到5个柳胺酚代谢产物(M1、M7-M10)。柳胺酚主要的代谢过程包括羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化和代谢性降解等。重组人肝药物代谢酶筛选结果表明CYPIA2与CYP2C9参与了柳胺酚的I相代谢反应；UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9、UGT287与UGT2815参与了柳胺酚的Ⅱ相代谢反应。
2.计算机分子对接拟合结果表明柳胺酚葡萄糖醛酸化代谢产物M8、M10以及柳胺酚羟基化代谢产物LAF-OH与RRM2活性位点的亲和力较柳胺酚更强。基于HepG2.2.15细胞及HepG2.A64细胞的HBV抑制实验发现LAF-OH对HBV的抑制活性较柳胺酚更强且成时间与剂量依赖性，可以显著降低野生型HBV及耐药突变HBV模型细胞培养上清中HBV-DNA、HBsAg以及细胞内HBV-DNA、cccDNA的水平。细胞增殖活性及细胞凋亡实验发现LAF-OH在HepG2.2.15细胞、HepG2.A64细胞、HepG2细胞与HEK293细胞中半数细胞增殖抑制剂量ICso分别为173.4μM、366.7μM、222.3μM与191.8μM，在150μM浓度时未对细胞凋亡造成明显影响。联合药效试验结果表明LAF-OH与拉米夫定、恩替卡韦联合抗HBV具有协同效应；LAF-OH与阿德福韦、替诺福韦联合抗HBV具有相加效应。
3.蛋白组学筛选发现LAF-OH处理后细胞细胞周期、IL-17信号通路及PPAR信号通路相关蛋白表达水平显著降低。WesternBlot分析发现LAF-OH可以通过抑制Akt磷酸化水平降低cyclinD1的表达水平。细胞周期分析结果表明经LAF-OH处理后S期细胞比例明显下降。进一步通过qPCR及WesternBlot分析发现LAF-OH可在不引起RRM2B表达代偿性上调的同时显著抑制RRM2蛋白表达水平下降。RR活性分析发现LAF-OH可通过同时抑制RRM2活性与表达水平的方式显著抑制RR活性。
结论
1.柳胺酚在体内主要通过羟基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、乙酰化及代谢性降解等途径代谢。CYP1A2、CYP2C9、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9、UGT287与UGT2815是柳胺酚主要的肝脏代谢酶亚型。
2.LAF-OH与RRM2活性位点具有较高的亲和力，其抗HBV活性较柳胺酚更高。LAF-OH在显著降低细胞培养基上清HBV-DNA、HBsAg与细胞内HBV-DNA、cccDNA水平的同时不产生明显的细胞毒性，具有良好的安全性。此外，LAF-OH对核苷类似物耐药HBV仍具有强大的抑制活性。LAF-OH在与核苷(酸)类似物联合使用时表现出相加效应或协同效应。
3.LAF-OH通过降低Akt磷酸化水平而下调cyclinD1的表达水平，改善因HBV感染造成的细胞周期紊乱，以降低S期细胞比例的方式下调RRM2的表达水平，同时不使RRM2B表达水平代偿性增高。LAF-OH在下调RRM2表达水平的同时与RRM2活性位点竞争性结合，从而大幅抑制RR活性，发挥抗HBV作用。LAF-OH可通过调节IL-17介导的免疫学反应以及PPAR、Akt等信号通路为HBV治疗带来更多潜在获益。