实验目的 颌下腺(SMG)作为人体三大唾液腺之一，不仅在人体的正常生理活动过程中发挥着不可缺少的作用，而且在疾病研究方面具有重要的价值。 作为SMG的组成部分，SMG导管的构建是SMG组织工程研究的一个重要方面。其基本的思路是在体外分离培养导管细胞，然后将一定量的细胞接种在具有一定空间结构的支架上，通过细胞之间的相互粘附、生长、增殖和分泌细胞外基质，形成具有一定结构和功能的组织或器官。但是由于体外培养的细胞失去了其它细胞的支持及各种生长因子的调控作用，目前尚存在生长缓慢，增殖能力较差等问题，给组织工程的进一步研究带来了困难。 因此不断地完善细胞培养条件，提高导管细胞的增殖能力，使导管细胞能够较好地粘附在预制结构的支架材料上，并在粘附后仍能够具有良好的活性功能，是形成组织工程化SMG导管组织的基本目的。 在本研究中，应用等密度梯度离心方法在体外进行SMG导管细胞的分离、纯化及培养，并探讨表皮生长因子(EGF)对导管细胞增殖能力的影响，同时将其作为种子细胞种植于生物材料表面，观察在体外复合培养条件下，SMG导管细胞的生长分化情况，为进一步建立组织工程化SMG导管的体外模型提供理论和实验依据。 实验方法 1．应用等密度梯度离心法进行SMG导管细胞的分离纯化，并进行SMG导管细胞原代培养和传代培养。 2．应用相差显微镜、透射电镜观察培养细胞的形态结构，了解细胞的生长特性。 3．培养细胞经MM法检测490urn吸光度A值门D值入判断细胞活力大刁。 4．免疫组织化学检测鉴定细胞来源及性质。测定培养细胞的淀粉酶活性，评价培养细胞的纯化程度。 5．加人不同浓度的EGF进行细胞培养，研究生长因子对大鼠SMG导管细胞增殖的剂量一效应、时间－效应关系，评价EGF对体外培养大鼠SMG导管细胞增殖的影响。 6．观察 EGF加人后，细胞内 Ca卜，cAMP浓度的变化，探讨 EGF作用的才关机制。 7．将传代培养的第2代细胞接种于胶原海绵表面进行培养，采用HE染色光镜观察、扫描电子显微镜及免疫组化观察SMG导管细胞接种于胶原海绵后，细胞的生长情况。 实验结果 一上MG导管细胞的分离纯化与体外培养 1．相差显微镜观察 导管细胞生长期间为多角形的上皮细胞，可传代生长3－－4代，存活3－－4w。 二．二 原代培养：在细胞悬液中获取的细胞形态呈球形，胞浆均匀明亮，轮廓清晰光滑。接种后24bed6h大部分细胞开始贴壁，折光性减低。48h细胞胞体逐渐延伸生长。培养4一天可见完全伸展的细胞呈扁平多边形，细胞大小是伸展前的 3一倍。培养至 9—11天，可见新生的导管细胞，呈大小均一的多角形，单层生长。 1．2 传代培养：细胞传代后较原代生长加快，24h后即可贴壁伸展，7刁天可形成单层细胞。第2代细胞形态与原代相似。细胞经反复传代后形态出现变化，从第3代开始出现细胞死亡，第4代死亡细胞数量增加，且细胞形态逐渐变得不规则，胞内出现细小空泡及黑色小颗粒。 ·2· 2．细胞增殖能力测定： 培养72h后删TI’法测得各代细胞的吸光度A值显示：原代。第2代与第 4代相比较有显著性差异帅＜0．05人 3．免疫组化染色： 免疫组化观察Anh－Pn cytokerahn、Anh－EMA染色呈（＋L说明培养的上层区带细胞以导管细胞为主。 4．培养液中淀粉酶活性测量结果： 上、下层细胞带上清液中淀粉酶活性与SMG细胞比较结果说明上层细胞内仅含有极少量腺泡细胞，纯化程度较高。 5．超微结构观察 透射电镜下观察培养的正常细胞可见细胞呈立方状，顶端有微绒毛，细胞核呈圆形，线粒体，内质网发达，胞浆内不含分泌颗粒。 二上GF对SMG导管细胞增殖作用的影响 1．EGF促细胞增殖的剂量－效应关系 在含 0．5＊ 培养液中细胞增殖呈剂量－效应关系冲＜0．01厂当浓度持续增大时，培养细胞的增殖能力则有所降低。 2．EGF促细胞增殖的时间－效应关系 与对照组比较，加人EGF作用第2天开始出现促增殖效应，第3天开始 EGF显示出明显的促增殖效应k＜0．01入第 5天时培养细胞的增殖能力开始降低。 3．细胞内Cah浓度的测量： 加人 EGF后可导致细胞内 Ca卜浓度改变，给药后 20s内可迅速达到峰值，然后缓慢下降，维持在较高水平，作用时间持续 5 min。 4．细胞内CAMP浓度的测量： 给药后3ndn时引起cAMP值快速的降低，而作用120min后cAMP浓度可恢复至基础水平。 三SMG导管组织构建的初步实验研究 二．组织学观察 HE染色可见细胞接种后第1天细胞数量较少，分散于胶原海绵支架中间，无细胞外基质的分泌；随着培养时间的延长细胞数逐渐增多，第7天细胞数量明显增加，细胞或吸附于材料表面，或分散在支架内，并聚集成集落。 ·3· 2．免疫组织化学