内毒素(脂多糖)是革兰氏阴性菌细胞外壁的主要成分，发牛内毒素血症时在机体内可与炎性细胞的受体接合，激活炎性细胞，合成和释放细胞因子，诱导全身炎症反应，从而导致脓毒性休克甚至多器官衰竭。新近研究发现，Toll簇受体(Toll-like receptors)可能是LPS跨膜信号转导的门户蛋白，影响细胞对内毒素的反应和宿主对细菌的防御反应。其中TLR2(Toll-like receptor2)和TLR4(Toll-like receptor4)作用尤为显著。以往研究主要集中于LPS对单核巨噬细胞上TLR2/4的影响；中性粒细胞(PMN)是机体重要的免疫细胞，在机体炎症反应中起着重要作用，脂多糖(lipopolysacchadde，LPS)对中性粒细胞TLR2和LR4有何影响尚不明确。异丙酚是常用的静脉麻醉药，研究发现异丙酚具有一定的抗LPS引起的炎症反应，异丙酚是否能够影响中性粒细胞的TLR2/g表达尚不清楚。本实验通过体外分离纯化PMN，观察LPS作用后PMN的TLR2/4表达，异丙酚预处理对PMN的TLR2/4表达的影响，异丙酚对内毒素刺激PMN后的功能变化，如PMN上粘附分子CD18的表达、呼吸爆发，IL-8(白介素-8)和肿瘤坏死因子-a(TNF-a)释放及PMN凋亡的影响。 试验方法： 1.标本采集与细胞分离提纯： 采集6位健康成年志愿者(年龄20-35岁)外周静脉血50 ml/位，加入20U/ml 肝素抗凝，用于分离中性粒细胞。采用密度梯度法分离纯化PMN，即先以淋巴细胞分离液将单个核细胞与中性粒细胞分离于不同液面，再用红细胞裂解液裂解残留的红细胞，PBS洗两次，用含10％胎牛血清的1640培养液重悬细胞。经瑞氏染色证实纯度＞90％，台盼蓝染色证实存活率＞95％。调节每组细胞浓度均为1×106个/ml。 2.实验分组及处理：将预处理好的PMN均分为六组：Ⅰ组(空白对照组，PMN+培养液)，Ⅱ组(异丙酚溶剂对照组，intralipid)，Ⅲ组(异丙酚组，终浓度5μg/ml异丙酚)，Ⅳ组(内毒素组，终浓度1μg/ml LPS)，V组(内毒素+溶剂对照组，intralipid+终浓度1μ g/ml LPS)，Ⅵ组(异丙酚+内毒素组，终浓度5 μg/ml异丙酚+终浓度1μg/ml LPS)。Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅴ组、Ⅵ组先加入异丙酚或(和)intralipid，在37℃，5％的CO2培养箱孵育20 min后(Ⅰ组不加样，但经同样条件预处理)，Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组中加入LPS，最后各组均于在37℃，5％的CO2培养箱孵育12小时。 3.研究方法与观察指标 (1)中性粒细胞黏附分子CD18的表达量：每组取100μ1细胞悬液，加入10μ 1 FITC Anti-Human CD18单克隆抗体，室温避光孵育30min，PBS洗2次，300μ1 PBS重悬细胞。 (2)呼吸爆发功能的测定：每组取100μ1细胞悬液，加入25μ1 DHR123(终浓度为4μg/ml)，37℃水浴箱避光孵育5 min，将盛标本的试管置于冰浴中以终止反应，PBS洗2次，300μ1PBS重悬细胞。 (3)中性粒细胞的凋亡率：每组取100μ1结合液重悬的细胞悬液，加入5μ1V/FITC和10μ1碘化丙锭溶液，混匀室温避光孵育15min，加入300μ1PBS重悬细胞。 (4)中性粒细胞TLR2、TLR4的表达量：每组取100μ1细胞悬液，分别加入5μ1FITC Anti-Human TLR-2、PI Anti-Human TLR-4单克隆抗体，室温避光孵育20min，PBS洗2次，300 μ 1 PBS重悬细胞。 (5)培养上清液TNF-a、IL-8的浓度：离心收集细胞培养液，采用ELISA法检测培养液中FNF-a、IL-8的浓度。 (6)中性粒细胞TLR2、TLR4、TNF-a、IL-8 mRNA表达：提取PMN的总RNA，反转录合成cDNA后，采用荧光定量PCR的方法检测中性粒细胞TLR2、TLR4、TNF-a、IL-8基因表达变化表达。 4.统计分析 所有数据采用SPSS12.0 for Windows进行处理。对数据进行正态性检验、方差齐性检验，正态分布的计量数据采用-x±s表示，应用方差分析进行分析；非正态分布以中位数(四分位数间距)[M(Q)]表示， 采用秩和检验(Wilcoxon Signed Ranks Test)；以P＜0.05表示差异有统计学意义。 结果： 1、PMN的呼吸爆发作用 Ⅴ组呼吸爆发作用较Ⅰ组增强(P＜0.05)；与Ⅵ组比较，Ⅴ组呼吸爆发作用增强(P＜0.05)；Ⅳ组呼吸爆发作用较Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均有升高趋势，但均无统计学差异。Ⅵ组较Ⅴ组呼吸爆发作用减弱(P＜0.05)。 2、PMN的凋亡率变化 Ⅳ、Ⅴ组PMN早期凋亡率小于Ⅰ组(P＜0.05)；与Ⅳ组比较，早期凋亡率较Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均减少(P＜0.05)，Ⅴ组早期凋亡率变化无统计学差异，Ⅵ组早期凋亡率较Ⅳ组升高(P＜0.05)。Ⅵ组早期凋亡率大于Ⅴ组(P＜0.05)。 3、PMN上CD18表达的变化 Ⅴ、Ⅵ组CD18表达较Ⅰ组有增高(P＜0.05)；与Ⅳ组比较，CD18表达较Ⅰ组有增高趋势，但无统计学差异。Ⅵ组CD18表达较V组有降低(P＜0.05)。 4、细胞培养液中IL-8、TNF-a的浓度 Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组中IL-8的浓度均大于Ⅰ组(P＜0.05)；与Ⅳ组比较；Ⅵ组IL-8的浓度较Ⅴ组降低(P＜0.05)。 Ⅳ组中TNF-a的浓度均大于Ⅰ组(P＜0.05)；与Ⅳ组比较，Ⅴ组细胞培养液中。TNF-a的浓度变化无统计学差异；与Ⅴ组比较，Ⅵ组TNF-a的浓度较Ⅴ组降低(P＜0.05)。 5、IL-8mRNA、TNF-amRNA表达 Ⅴ组IL-8mRNA表达较Ⅰ、Ⅱ组升高(P＜0.05)；Ⅳ组中IL-8mRNA表达量均大于Ⅰ组，Ⅵ组较Ⅳ组有降低趋势，但均无统计学差异；与Ⅴ组比较，Ⅵ组IL-8mRNA表达降低(P＜0.05)，但亦无统计学差异。 Ⅵ组中TNF-a mRNA的表达量小于V组中TNF-a mRNA的表达量(P＜0.05)，其余各组两两比较无差异。 6、PMN上TLR2、 TLR4表达的变化 Ⅳ、Ⅴ组TLR2表达较Ⅰ组升高，V组TLR4表达较Ⅰ组升高(P＜0.05)，与Ⅳ组比较，Ⅴ组TLR2、TLR4表达变化无统计学差异，Ⅵ组TLR2表达较Ⅳ组降低(P＜0.05)。与Ⅴ组比较，Ⅵ组TLR2、TLR4表达降低。 7、TLR2mRNA、TLR4mRNA表达 Ⅴ组TLR2mRNA表达较Ⅲ组升高(P＜0.05)；Ⅳ、Ⅴ组TLR2mRNA表达较Ⅰ组有升高趋势，Ⅵ组TLR2mRNA表达较Ⅳ、Ⅴ组均有降低趋势，但均无统计学差异 Ⅳ组TLR4mRNA表达较Ⅰ组有升高趋势，Ⅵ组TLR4mRNA表达较Ⅴ组有降低趋势，但均无统计学差异。 结论： 1、内毒素可使呼吸爆发能力增强、凋亡延迟、增加PMN粘附分子CD18的表达。 2、异丙酚可减弱PMN呼吸爆发功能、改善PMN凋亡障碍、降低内毒素刺激下PMN粘附分子CD18的表达增加。 3、内毒素可诱发PMN释放炎症介质IL-8、TNF-a释放增多。 4、异丙酚能抑制IL-8、TNF-a的释放，可降低内毒素诱发的IL-8、TNF-a基因表达 5、内毒素可刺激PMN细胞膜上TLR2、TLR4表达增加。 6、脂肪乳溶剂对正常和内毒素刺激下PMN功能和TLR2/4表达影响不大 7、异丙酚对正常PMN功能和TLR2/4表达影响不明显。 8、异丙酚可抑制内毒素引起的PMN膜上TLR2、TLR4表达增加。