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本文采用RT-PCR技术对来自山东地区共7株猪瘟病毒进行E2基因的扩增、克隆和测序,得到长度为1092bp编码364个氨基酸的目的基因片段,并分离鉴定了其中的5株流行毒株。
应用DNAStar序列分析软件对所测定的7株猪瘟病毒E2基因与已知序列的HCLV、Shimen毒株的相应片段进行同源性分析比较。结果显示,山东株与HCLV、Shimen株的核苷酸同源性分别为81.6%~82.3%和83.4%~84.2%,推定的氨基酸同源性分别为87.9%~89.6%和89.3%~90.1%。山东毒株之间核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为95.3%~99.7%和96.2%~99.2%。山东的7株病毒的E2蛋白的15个Cys位点没变,可推测CSFVE2蛋白在抗原结构方面依然保持很高的稳定性。在具有中和特性的B、C区域内725位、729位、734位和738位氨基酸位点发生了变异,这些变异可能导致E2蛋白的抗原性发生改变。
将7株山东流行毒株与国内外已发表的18株CSFV相应序列进行比较,并建立遗传进化树。该遗传树主要分为两大群,山东毒株皆属于基因群Ⅱ,但我国的主要参考毒株HCLV、Shimen则属于基因群Ⅰ,说明山东流行CSFV株与HCLV、Shimen有很大差异。
根据已发表的猪瘟病毒Shimen株、HCLV株和Paderborn株的全基因组序列,设计并合成11对引物,应用RT-PCR技术,成功地分11个片段扩增了CSFV山东流行毒株SDJN5的全基因组,并将这11个基因片段克隆到PMD18-T载体上,测定其核苷酸序列。应用生物软件VectorNT1Suite6将11个基因片段进行拼接,确认CSFVSDJN5株全基因组序列的长度为12298个核苷酸。将CSFVSDJN5株与国内外已发表的Shimen、HCLV、39、Brescia、Eystrup、Glentorf、Alfort、Paderborn、CS、ALD、GPE-、LPC、CF114毒株进行全基因组序列和推定的氨基酸序列比较,结果显示,核苷酸同源性分别为85.3%、84.5%、88.4%、85.7%、85.6%、85.3%、85.6%、95.2%、85.6%、85.6%、85.4%、84.2%、85.5%,推导的氨基酸序列同源性分别为92.6%、91.7%、94.2%、93.1%、92.9%、92.3%、93.0%、97.7%、92.6%、93.0%、92.6%、90.6%、92.8%。SDJN5与Shimen、HCLV的全基因组序列及推定的氨基酸序列相比有明显变异,表明SDJN5与Shimen、HCLV在遗传性和抗原性上存在较大差异。系统发育树分析表明,所比较的14株CSFV被分为两个群,SDJN5、Paderborn和39这3个毒株被归为基因群Ⅱ,其余的11个毒株被归为基因群Ⅰ,SDJN5与Paderborn的亲缘关系最接近。