前言 脑缺血以后神经细胞死亡的形式之一即是细胞凋亡，bcl-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2 gene)作为一种抗凋亡基因，在大量研究中证明对缺血性脑损伤后神经细胞具有保护作用，bax基因(bcl-2 associated x gene)被认为是一种凋亡促进基因，与bcl-2共同调节凋亡。随着分子生物学和基因工程的发展，基因治疗可能为临床治疗脑梗死提供一个新思路、新方法。目前基因治疗脑梗死的实验研究多采用病毒载体，多因其安全性难以保障，很难应用于临床。本实验组此前的研究曾将质粒pLXSN介导的人bcl-2基因直接注射于大鼠脑梗死周围区，即相当于缺血半暗带脑细胞旁，证明其可以安全、有效的抑制局灶性脑缺血大鼠神经细胞凋亡。但由于局部直接注射的转基因方式创伤性大，且不易于使转入的基因在全脑内发挥作用，所以不适于临床应用。为了寻求更加方便、快捷、安全、有效的治疗方法，本研究以质粒pLXSN作为载体转染人bcl-2 cDNA，经侧脑室注入大鼠大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，观察缺血再灌注不同时间点的脑梗死体积、bcl-2/bax蛋白表达、细胞凋亡的动态变化情况，探讨质粒pLXSN介导人bcl-2基因在局灶性脑缺血中的脑保护作用，为临床治疗脑梗死提供实验依据。 方法 依照常规的分子生物学方法鉴定、提取及扩增质粒pLXSN和质粒pLXSN-bcl-2。将180只大鼠均采用Zea-longa线栓法制成大鼠MCAO模型，随机分为3组：生理盐水组(n=60)、空载质粒组(n=60)和bcl-2组(n=60)。采用立体定位的方式于MCAO后立即经侧脑室分别注入生理盐水、质粒pLXSN和质粒pLXSN-bcl-2 20μl。采用TTC染色、免疫组织化学、原位末端标记(TUNEL)法分别观察并检测脑缺血再灌注3h、6h、24h、48h、72h后的脑梗死体积、bcl-2/bax蛋白表达和神经元凋亡状况。结果 (l)TTC染色法检测各组大鼠脑缺血再灌注不同时间点的脑梗死体积，采用显微图像分析系统采集、分析各组标本图像。与生理盐水组、空载质粒组相比，bcl一组各时间点大鼠脑梗死体积较同一时间点梗死体积缩小(P<0.05)。各组脑梗死体积大小在24h以前均随缺血再灌注时间延长而逐渐增大，24h达峰值，以后逐渐减小。 (2)免疫组化法检测各组玩1一/bax蛋白表达阳性细胞面积百分比，采用显微图像分析系统采集、分析各切片图像。 ①bcl-2蛋白表达情况。与同一时间点的生理盐水组、空载质粒组相比，bd一2组各时间点bcl一2蛋白表达增多(P<0.01)。生理盐水组与空载质粒组bcl一蛋白表达于3h开始缓慢增多，至48h达峰值，随后逐渐减少，bcl-2组于6h内缓慢增加，6h开始迅速增多，24h达峰值，随后逐渐减少。 ②Bax蛋白表达情况。各组的bax蛋白表达在缺血再灌注3h时间点比较均无明显差异(P>0.05)，6h时间点bcl一2组较空载质粒组有所减少(P<0.05)，生理盐水组与空载质粒组比较无明显差异(P>0.05)，在随后的24h至72h，bcl一组较生理盐水组、空载质粒组同一时间点表达均有所减少(P<0.05)。各组bax蛋白表达于缺血再灌注6h内无明显变化，6h开始bcl一2组表达缓慢增加，而生理盐水组、空载质粒组增加较迅速，均于48h达峰值，随后逐渐降低。 (3)TUNEL法检测各组神经细胞凋亡情况，显微镜下计数凋亡神经细胞数。与同一时间点的生理盐水组、空载质粒组相比，bcl一2组各时间点凋亡神经细胞数量减少(P<0.01)。各组凋亡神经细胞数均随缺血再灌注时间延长而逐渐增多，72h内未达峰值。讨论 将p以SN一bcl一cDNA用立体定向技术注人脑缺血大鼠侧脑室，结果显示，与同一时间点的生理盐水组、空载质粒组相比，bcl一2组各时间点的bcl-2蛋白表达均显著增高;缺血再灌注6小时后bax蛋白表达有所下降;各个时间点的细胞凋亡数均明显减少;脑梗死体积亦有所缩小。说明此种转基因途径能有效的增加hcl一基因蛋白表达、下调bax基因蛋白表达，抑制神经细胞凋亡、缩小脑梗死灶、起到脑保护作用。缺血脑组织具有摄取外源性bcl一2基因并表达它的能力，而且正因为如此才使bcl一蛋白增高到一定程度而达到治疗作用，这可能是转bcl一基因治疗脑梗死的作用机制之一，但外源性bcl一cDNA如何被摄取及表达的机制尚不明确。结论 局灶性脑缺血后，经侧脑室注入质粒pLXSN介导人bcl一cDNA，在缺血早期即可抑制细胞凋亡、提高缺血半暗带的bcl一2/bax蛋白表达比率、缩小脑梗死体积，起到脑保护作用。外源性玩l一基因蛋白表达增高、bax蛋白表达水平被下调可能为其机制之一。