纤维蛋白凝胶管状支架在小口径组织工程血管培养中的应用研究

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利用组织工程的方法获取血管移植材料来解决小口径(<6mm)血管移植物临床供给不足的缺陷是目前血管界和材料界的研究热点之一,合适的支架材料是小口径组织工程血管体外成功构建的关键。天然纤维蛋白水凝胶管状支架对比其它合成高分子支架材料具有独特的自身优势,但应用纤维蛋白凝胶支架时需要使用氨基己酸(ACA)来维持其稳定性的方法不利于细胞的长时间培养。本研究将探究氯化钠(Na Cl)替代氨基己酸来获取适合小口径组织工程血管培养的纤维蛋白凝胶管状支架的可行性,并对其性能进行评估。本研究首先使用纤维蛋白原、凝血酶以及氯化钙作为基础原料,采取温度控制等技术步骤获得纤维蛋白凝胶材料,并对材料进行性能表征以及微观结构观察;其次利用特定的管状模具制备纤维蛋白凝胶管状支架,并使用支架材料包埋人血管外膜来源的成纤维细胞进行培养,从而评估其细胞相容性。然后将不同浓度的Na Cl添加剂替代ACA来获取纤维蛋白凝胶管状支架,并与相同条件下添加了ACA的管状支架进行性能比对,并检测了支架在包埋人成纤维细胞后对细胞的增殖与分泌细胞外基质的影响;最后采用体外生物反应器对改良后的纤维蛋白凝胶管状支架进行三维组织工程血管构建的短期效果评价。结果显示,该制备方法获得的纤维蛋白凝胶整体外观呈现为乳白色,外表光滑、厚度均匀;测得凝胶平均成胶时间为(172.0±4.7)s,吸水率为(34.50±1.87)%,完全降解时间为7d,杨氏模量为(2624±295)Pa,凝胶整体结构具有一定稳定性;微观结构呈现为多孔隙网状纤维,纤维直径为(0.41±0.03)μm,网状纤维平均孔隙大小为(47.87±9.60)μm~2,内部含水量高;包埋人成纤维细胞后,细胞在凝胶中形态完整、分布均匀,存活情况良好。此外,在纤维蛋白凝胶前体溶液中添加不同浓度(0.9%、1.8%、2.7%、3.6%、4.5%w/v)Na Cl可以调控凝胶的微观结构和力学性能,与添加0.3%(w/v)ACA的凝胶相比,添加Na Cl使凝胶透明度显著增加,凝胶成胶时间显著减少,纤维直径显著减小,纤维孔隙显著增大,并且在1.8%(w/v)Na Cl浓度时凝胶力学稳定性显著提升,此时凝胶表现为疏松多孔、纤维粗细均匀。利用不同浓度Na Cl制得的凝胶管状支架包埋细胞培养2周,显示添加一定浓度Na Cl与添加0.3%(w/v)ACA制备的凝胶在包埋细胞活性和增殖细胞比例上有显著差异,其中添加1.8%(w/v)Na Cl组凝胶包埋的细胞与添加0.3%(w/v)ACA的对照组相比活性显著更高,细胞增值速度显著更快;将其转移至灌流式生物反应器在力学刺激条件下培养2周时间,可见细胞分泌的细胞外基质厚度显著更厚,细胞数目显著增加。纤维蛋白凝胶支架是一种理想的高含水性多孔隙生物支架材料,细胞相容性好;1.8%(w/v)Na Cl溶液作为纤维蛋白凝胶最适浓度的添加剂,可完全实现在组织三维培养过程中对ACA替代,并在血管培养生物反应器上得到了初步应用,这将为小口径组织工程血管移植物的构建提供一种极有前景的天然生物支架材料,并为定制开发各种组织工程生物支架提供了依据。
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