大豆与根瘤菌共生固氮可提供其所需氮素的50-60%。但大豆结瘤是一个高需磷过程,结瘤期大豆相较于其他生长发育时期需要更多磷素营养,低磷胁迫影响根瘤生长和发育,降低固氮酶活性,减少生物固氮,影响植物生长,降低产量和品质。鉴于此,本研究以磷高效品种‘中黄15’和磷低效品种‘牛毛黄’在接种根瘤菌的同时进行正常磷和低磷处理,测定结瘤固氮相关性状,并对两个品种不同磷处理下28 d成熟根瘤进行转录组测序,筛选磷响应相关基因GmSPX8和GmCCD8,研究其在根瘤中的功能,并初步解析作用机制,为大豆高效固氮育种提供功能基因,为提高低磷胁迫下大豆结瘤固氮相关基因的高效利用奠定理论基础。主要研究结果如下:1.不同磷处理下大豆品种接种根瘤菌28 d的生长及结瘤固氮相关性状存在显著差异。低磷胁迫与正常磷相比,中黄15株高下降13%,地上部鲜重、干重下降16%和32%,地下部鲜重、干重下降16.9%和26.5%,根瘤鲜重、干重下降46.6%和51.6%,根瘤数下降30.1%,地上部和根瘤氮含量降低45.2%和13.8%、磷含量降低70.3%和39.8%;牛毛黄株高降低25.0%,地上部鲜重、干重下降42.2%和40.9%,地下部鲜重、干重下降28.8%和28.5%,根瘤鲜重、干重下降60.8%和57.9%,根瘤数下降37.2%,地上部和根瘤氮含量降低44.2%和13.4%、磷含量降低72.9%和50.2%。2.不同磷处理下两个大豆品种基因表达存在差异。转录组数据显示,不同磷处理条件下,磷高效品种中黄15差异表达基因7723个,磷低效品种牛毛黄差异基因1440个,两品种共同上调差异基因737个,选取19个共同上调表达基因进行qRT-PCR验证,筛选出GmSPX8和仅在中黄15特异上调表达基因GmCCD8进行后续功能验证。3.GmSPX8响应低磷胁迫并影响结瘤固氮。GmSPX8主要在根瘤中表达,随根瘤的生长发育其表达量逐渐增加,并受低磷胁迫诱导;低磷胁迫下,转GmSPX8启动子根瘤GUS酶活性显著高于正常磷,GmSPX8超表达复合植株根瘤数、鲜重、固氮酶活性和磷含量均较野生型显著提高。其中,磷高效品种中黄15低磷胁迫下根瘤数、根瘤鲜重、根瘤磷含量和固氮酶活性分别提高10.4%、16.5%、35.0%和37.8%;而GmSPX8 RNAi结瘤固氮相关性状较野生型明显下降。4.GmSPX8与转录因子GmPTF1互作增强其转录活性。通过酵母双杂、BiFC、Pull-down技术验证了 GmSPX8与GmPTF1的相互作用;GmPTF1实时定量分析证明其表达量不随根瘤生长发育而变化,却受低磷诱导,并且GmSPX8超表达根瘤中GmPTF1表达显著上调,推测GmSPX8对GmPTF1起正向调控作用;GmPTF1转录激活活性验证发现,该转录因子在GmSPX8的作用下转录活性上升。5.证明GmCCD8在根瘤中参与低磷胁迫和结瘤固氮。低磷处理下GmCCD8表达量高于正常磷,且GmCCD8启动子GUS染色随根瘤发育逐渐加深;GmCCD8过表达复合植株的表达量较野生型提升2.3倍,固氮酶活性和根瘤鲜重分别提高30.0%和40.0%。透射电镜显示GmCCD8 RNAi根瘤内泡囊受损,或变为边缘不规则长椭圆形,类菌体减少且PHB积累降低,说明GmCCD8干扰严重影响根瘤泡囊形成和结构,破坏根瘤菌与大豆共生互作。基于以上结果,结论如下:低磷胁迫严重影响大豆植株生长和结瘤固氮,降低株高,植株鲜干重,地上部氮、磷含量,根瘤鲜重、干重,根瘤数,根瘤氮、磷含量;GmSPX8主要在根瘤表达且受低磷诱导,低磷胁迫下,转GmSPX8启动子-GUS根瘤GUS酶活性高于正常磷,超表达复合植株根瘤数、鲜重、固氮酶活、磷含量等显著增加,RNAi相应性状明显降低;GmSPX8与转录因子GmPTF1互作,过表达GmSPX8导致转录因子GmPTF1表达量显著上升,增强GmPTF1转录活性;GmCCD8主要在根瘤表达且受低磷诱导;超表达GmCCD8根瘤固氮酶活性和根瘤鲜重显著增加,而RNAi相应性状显著下降。