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药物致QT间期延长的副作用已成为威胁公众用药安全的重要问题,也是目前药物安全管理部门和药物公司广泛关注的药物心脏毒性问题。很多药物可以通过直接阻断心肌复极中的快速激活延迟整流钾通道电流(IKr),使得复极时程延长,导致QT间期延长,甚至发生尖端扭转性室性心动过速或心源性猝死；也可以通过干扰钾通道蛋白的表达,间接减少IKr,使得QT延长。药物对心脏复极的不良影响成为美国食品和药品管理局(FDA)终止药品上市的主要原因之一,并要求所有药物上市前必须进行这方面的评价。对IKr电流的测定成为判断药物是否能引起QT延长及是否易产生促心律失常作用的一个指标。因此,本研究拟从细胞离子通道、蛋白水平上建立一套临床前在体外评价药物对心脏复极影响的方法,并应用药物进行评估。据此,本研究设计了三个分实验。第一部分：建立表达HERG基因的HEK293细胞模型,并培养出稳定转染的HERG-HEK293细胞株；第二部分：用已知导致QT间期延长的药物西沙比利来测定该药对HERG通道电流的影响,进一步明确该通道的特性,并评价西沙比利对HERG通道蛋白的影响；第三部分：评价我国的一类抗心律失常新药——盐酸关附甲素对HERG通道电流、通道动力学的影响,并对HERG基因F656C突变后的电流进行测定,明确药物与HERG通道结合位点；应用免疫蛋白印迹技术(Western blot)评价关附甲素对蛋白表达的影响。第一部分：HERG-HEK293细胞表达模型的建立目的：通过基因转染的方法把HERG基因转染进HEK293细胞,使之表达HERG通道钾电流及蛋白,达到建立HERG-HEK293细胞表达模型的目的。方法：利用LipofectamineTM2000将pCDNA3.0-HERG和绿色荧光蛋白(GFP)瞬时转染进入HEK293细胞,利用膜片钳技术测定HERG-HEK293细胞上的HERG钾电流；应用G418对瞬时转染的阳性克隆细胞进行筛选,进而利用免疫蛋白印迹技术(Western blot)测定HERG-HEK293细胞的HERG蛋白的表达。结果：LipofectamineTM2000介导的瞬时转染成功率在30-70%,该方法有效地将HERG基因转染进入HEK293细胞,并表达HERG介导HERG通道钾电流；G418可成功筛选HERG基因阳性的克隆细胞,使得瞬时转染的HERG-HEK293细胞达到稳定转染,并可用于Western blot的研究。结论：荧光显微镜检查、膜片钳及Western blot研究证实该HERG-HEK293细胞表达模型的建立成功的。第二部分：西沙比利对HERG基因表达的快速激活延迟整流钾通道电流及蛋白的影响目的评价西沙比利对转染HERG基因表达的快速激活延迟整流钾电流(IKr)和蛋白的影响,探讨其致心律失常发生的机制。方法使用脂质体介导的瞬时转染法把野生型HERG基因转染进人胚肾细胞(HEK293),采用全细胞膜片钳技术评价西沙比利对IKr通道电流和动力学的影响；使用G418筛选出稳定转染HERG的细胞,并用西沙比利进行干预,应用免疫蛋白印迹技术(Western blot)评价药物对蛋白的影响。结果西沙比利对IKr通道的刺激电流(ⅠHERG)和尾电流(Itail)具有浓度和电压依赖性抑制作用,半数最大抑制浓度(IC50)分别14.5和3.9 nmol／L。西沙比利使ⅠHERG和Itail的最大峰值电位前移,但不改变激活电位；使激活曲线左移并加快通道的失活,但不改变通道失活后的恢复时间；西沙比利对HERG-HEK293细胞上的IKr通道蛋白无明显抑制。结论西沙比利通过作用于通道的激活态及失活态抑制HERG钾电流,但不影响HERG通道蛋白的表达,从而使得心肌复极时程延长,导致心律失常发生。第三部分：关附甲素对转染HERG基因表达的快速激活延迟整流钾通道电流和蛋白的影响[摘要]目的评价关附甲素(GFA)对HERG基因表达的钾通道电流和蛋白的影响。方法使用脂质体介导的瞬时转染法把野生型HERG基因转染入人胚肾细胞(HEK293),使之表达快速激活延迟整流钾电流(IKr),采用标准的全细胞膜片钳技术记录IKr通道电流,观察不同浓度的关附甲素对IKr的影响并进行通道动力学研究。采用定点突变技术使HERG基因产生F656C突变,并应用膜片钳进行药物对电流影响的测定。应用免疫蛋白印迹技术(Western blot)评价关附甲素对HERG钾通道蛋白的影响。结果1.关附甲素对IKr通道的峰电流IHERG具有浓度和电压依赖性抑制作用,半数最大抑制浓度(IC50)为465.95μmol／L；400μmol／L和1000μmol／L的关附甲素使IHERG的最大峰值电位前移,但不改变激活电位。25-400μmol／L的关附甲素对尾电流(Itail)抑制不明显,1、2.5和5mmol／L的关附甲素对抑制率分别为34.9%、58.0%和70.5%,IC50为1.64mmol／L。1mmol／L的关附甲素对Itail呈电压依赖性,并使得最大峰值电位前移,电流-电压曲线的形状产生变化,但对激活电位没有影响。关附甲素对HERG通道电流的抑制无时间依赖性。2.关附甲素可以使得通道的激活曲线左移并能加快通道的失活过程,并且能在-60mV的电压上减慢通道失活后的恢复时间,而对去激活时间常数无明显影响。3.关附甲素对F656C突变的HERG通道峰电流(ⅠHERG)和尾电流(Itail)具有抑制效应,但抑制程度比野生型HERG电流明显减弱,并使得激活曲线左移。4.高浓度的关附甲素可抑制HERG钾通道蛋白的转运,且对F656C突变表达的HERG钾通道蛋白抑制更明显。结论25～400μmol／L的关附甲素对IKr的抑制作用不明显,高浓度的关附甲素可以抑制]HERG电流,关附甲素主要是作用于HERG通道的失活态和激活态,并且主要是结合在HERG通道的S6区从而抑制钾电流。关附甲素不影响HERG蛋白的合成,但高浓度的关附甲素可抑制HERG蛋白的转运。