幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是全球人群中感染率最高的一种革兰氏阴性致病菌，在某些发展中国家，其感染率可高达70％以上。Hp感染与人体慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病的发生密切相关。目前，临床上主要采用抗生素治疗Hp的感染，短期内虽有较好的疗效，但由于存在细菌耐药性不断增加、治疗费用高、不能防止复发和重复感染等问题，使这类方案的实用性受限。据文献，免疫接种对Hp感染同时具有预防和治疗的作用，因此，Hp疫苗的研制已成为全球医学研究的热点。 在疫苗研究中，筛选高效的免疫抗原是关键性的环节。目前，虽然已经对多种Hp抗原的免疫活性进行了鉴定，但至今尚未找到一种免疫保护效果令人满意的抗原成分，对更多Hp抗原的免疫活性和免疫效果进行研究，必然是Hp疫苗研究的一个重要发展方向。 据报道，相当多的革兰氏阴性细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。Omp11是Hp的一种外膜蛋白，其编码基因具有高度的保守性，有望成为重要的免疫抗原，但目前国内外均未检索到有关Omp11抗原活性和免疫保护性的报道。Lpp20是Hp的另一种外膜蛋白，有研究表明，从Hp菌体培养基中提取的Lpp20具有良好的免疫原性和免疫保护性，但采用这种方法制备疫苗抗原较为困难，应用基因克隆的方法可以使Lpp20抗原的制备和免疫学研究获得更大进展。因此，本研究对这两种Hp外膜蛋白基因及其表达产物进行了如下探讨。 ①采用本室分离的Hp菌株MEL-HP27和标准菌株NCTC11637，分别对Hp omp11基因和lpp20基因进行克隆和测序，应用生物信息学方法分析基因序列的变异性和表达郑州大学博十学位论文幽门螺杆菌。mpll和lpp20基因的克隆与表达产物免疫原性和保护效果研究蛋白的免疫学分子特征;②分别构建表达这两个基因的原核高效表达载体，并对表达的重组蛋白进行纯化和免疫原性分析;③建立Hp感染的小鼠动物模型;④应用该动物模型对ompll和IPp20基因表达产物的免疫保护效果进行研究;以确定这两种重组蛋白作为疫苗抗原的应用价值，为研制高效的Hp疫苗奠定基础。 实验方法 1.Hp ompll和一ppZo基因的克隆及序列分析 采用本室从郑州胃炎患者胃部分离的Hp菌株MEL一HP27和国际标准菌株NcTcll637的染色体DNA为模板，用PcR方法，得到omPll基因片段，将其插入到克隆载体PNEB 193中，用重组质粒转化大肠杆菌，对重组质粒进行酶切鉴定，对插入片段进行测序。IPP20基因的PCR反应采用MEL一Hp27菌株染色体DNA为模板，余下克隆过程与omPll基因相同。应用生物信息学软件omiga 2.0和GenBank数据库分析Hp ompH和lpPZo基因序列的变异性，并分析其表达蛋白分子的免疫学特征。 2 .Hp ompn和IPp20基因高效表达载体的构建、表达和表达产物的纯化和免疫活性研究 用限制性内切酶从前面构建的重组质粒中切下ompll和IPp20基因，用DNA连接酶，将目的基因连接到原核表达载体pMAL一cZX中，然后转化大肠杆菌，得到能够使目的基因和麦芽糖结合蛋白基因融合表达的重组表达载体。用酶切和PCR方法鉴定重组质粒。采用IPTG进行诱导表达。用多糖树脂制备亲合层析柱，纯化表达的重组蛋白romPll和:Lpp20。应用sDs一队GE方法对表达产物和纯化产物进行分析。用纯化的romPll、rLPP20和Hp菌体抗原免疫小白鼠，用制备的免疫血清与重组蛋白进行Westemblot反应。 3.建立HP感染的小鼠动物模型 将20只昆明小鼠随机平均分成实验组和对照组。所有动物接种前禁食24hr，禁饮水4hr。实验组小鼠每只灌喂HP菌液200川(含Hp菌体sx1o勿Fu)，对照组用等体积液体布氏培养基代替菌液。接种后继续禁食4hr。攻击感染共3次，间隔Zd。于末次攻击感染后28d处死小鼠，剖腹采集胃和其它消化道脏器样品，进行尿素酶实验和组织切片染色检查。 4.重组蛋白romPll、rLpp20及rHu免疫保护活性分析 rHU为基因重组的Hp hsPA和ureB融合基因的表达产物，来自本室其它研究。采郑州大学博士学位论文幽门螺杆菌ompll和lpp20基因的克隆与表达产物免疫原性和保护效果研究用重组霍乱毒素:CTB为免疫佐剂。将小白鼠分成6组，4个实验组的小鼠分别用romp 11+rCTB·rL即20+rCTB、rHU+rCTB、rHU+rL即20+rompll经口免疫，这些抗原均溶于相同的缓冲液中;2个对照组的小鼠分别经口灌喂rCTB和缓冲液。每周l次，共免疫4次。距末次免疫7d后，各组均用Hp进行攻击感染，每次每只小鼠经口灌喂Hp菌液200川(5 X IO8cFu)，共接种2次，间隔shr。在攻击感染后14d处死小鼠，取鼠胃作尿素酶定性试验和半定量试验、Hp培养、涂片Gram，s染色镜检和组织学检查，检测免疫接种对Hp在小鼠胃内定植的影响。 5.统计学分析 应用统计软件SPSS12.O，计量资料的比较采用单因素方差分析，计数资料的比较采用才检验或Fisher确切概率法，以a=0.05为检验水准。 结果与分析 1·Hp omPll基因和IPp20基因的克隆及序列分析 酶切鉴定和测序结果显示，Hp omPll基因和IPp