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研究背景肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,位居全球恶性肿瘤第五位,。在所有恶性肿瘤中,HCC的死亡率位居第三位,每年有大约60万人死于HCC。目前,临床上公认的HCC治疗方式主要是以手术和放化疗治疗为核心的综合治疗方案,但是由于HCC恶性程度高,且当患者确诊时患有HCC时常已是中晚期,错过了最佳治疗时间。由于HCC死亡率较高,被认为是一个多种因素参与的与多种基因有关的复杂的疾病。癌基因和抑癌基因等的异常表达和多条信号通路以及生长因子的激活参与了HCC的发生发展过程。研究HCC发病机制、寻找新的临床诊断标记物和治疗靶点是具有重要意义。mi RNA是一类内源性非编码小RNA分子,长度约为21-23 nt。mi RNA的主要生物学功能是在转录后水平上对调节基因的表达,结合靶基因的3’非翻译区(3`UTR)的,调控降解靶基因的mRNA或者抑制蛋白质的翻译。miRNA介导的细胞调控几乎涉及参与全部的细胞进程,包括早期发育以及细胞的增殖、分化、凋亡和细胞周期、代谢等。近年来,许多研究表明mi RNA在各种肿瘤组织中的表达异常,可能发挥了癌基因或者是抑癌基因的功能,这提示miRNA与肿瘤的发生发展密切相关。因此深入研究mi RNA在肿瘤中的生物学功能以及在肿瘤发生发展中的分子机制具有重要意义,有利于肿瘤的临床诊断和预后治疗。CDK6属于丝氨酸苏氨酸激酶家族。CDK6编码细胞周期依赖性蛋白激酶6主要通过与周期蛋白CCND1和CDK4结合,从而在CDK6激活后,促进转录因子和Rb的磷酸化,促进细胞周期的进程,在细胞的增殖和分化发挥重要的调控作用,然而它与肝癌的发生发展以及预后的关系目前还不是很清楚。研究目的检测mi R-145在不同肝癌细胞株、肝癌组织及癌旁组织中的表达水平,体外研究mi R-145对肝癌细胞株增殖及侵袭迁移的影响,采用生物信息学软件分析mi R-145下游靶基因并研究靶基因CDK6在肝癌组织中的表达情况。研究方法1、首先选取4个肝癌细胞系hepg2、hle、h2p、smmc及正常肝细胞系l0-2,采用荧光定量pcr方法检测mir-145的表达差异。同时检测mir-145在肝癌组织及癌旁组织中的表达差异。2、将mir-145mimic和mir-nc分别使用脂质体lipofectamine2000转染hle和smmc细胞,转染mir-nc作为阴性对照组。real-timepcr检测转染后mir-145的表达情况。cck8法检测mir-145对hle和smmc细胞增殖的影响并绘制生长曲线;transwell实验检测mir-145对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。3、运用生物信息学分析的方法,预测mir-145下游的靶基因并用双荧光素酶报告基因检测进行验证。mir-145mimic转染hle和smmc细胞,用real-timepcr和westernblot检测下游靶基因cdk6的表达水平。4、采用荧光定量pcr检测50例hcc组织以及癌旁组织中cdk6的表达情况。对之前测得的肝癌组织中mir-145表达量与cdk6的表达量进行相关性分析,分析mir-145和cdk6之间的关系。研究结果:1、real-timepcr检测肝癌细胞系中mir-145的表达量,其明显低于人正常肝细胞l0-2细胞(p<0.05)。50例肝癌组织中mir-145相对表达量为1.9943±0.8400,明显低于癌旁组织2.8222±0.8052(p<0.001)。2、hle和smmc细胞转染mir-145mimic后real-timepcr检测证实mir-145成功过表达。cck8结果显示:肝癌细胞过表达mir-14548h后,活细胞数量明显低于对照组(p<0.01)。肝癌细胞smmc和hle过表达mir-145后,细胞侵袭能力分别为对照组的48%和48%,迁移能力降为对照组的67%和54%,两者均有统计学差异(p<0.01)。3、用生物信息学软件对mir-145的潜在靶基因进行了预测,双荧光素酶方法证实mrnacdk6为mir-145的下游作用靶点之一。real-timepcr和westernblot均证实mir-145过表达后,cdk6的表达量明显下调。4、采用real-timepcr检测肝癌组织中cdk6相对表达量为2.7910±1.6093,明显高于癌旁组织1.7082±0.9804,结果有统计学差异(p<0.001)。我们对肝癌组织中mir-145表达及cdk6的表达水平进行相关性分析,分析结果表明mir-145与cdk6的表达呈负相关,结果具有统计学意义(r=-0.257,p<0.01)。结论:1、miR-145在肝癌细胞株及肝癌组织中明显低表达。miR-145过表达可以显著抑制肝癌细胞株SMMC和HLE细胞的增殖,侵袭及迁移能力。miR-145可作为一个临床诊断的候选标志物。2、m RNA CDK6为mi R-145的下游作用靶点之一。mi R-145可以靶向负调控SMMC和HLE细胞中CDK6的表达水平。3、CDK6在肝癌组织中高表达,且与miR-145的表达呈负相关。mi R-145-CDK6介导的信号通路可能在肝细胞癌的发生发展过程中发挥重要作用。