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第一部分儿童原发性肾病综合征中B细胞异常及与血清IgG水平的关系
目的：原发性肾病综合征(Primary nephrotic syndrome, PNS)患儿血清中的IgG水平显著降低，其继发免疫功能低下所致的感染与该病的复发，频复发密切相关。尿中IgG的丢失不能完全解释低IgG血症的发生，提示肾病患儿体内存在分泌免疫球蛋白的B细胞体液免疫功能紊乱。本部分实验目的主要为明确肾病综合征中是否存在B细胞的功能障碍，参与低IgG血症的发生。
方法：于重庆医科大学附属儿童医院肾脏内科收集住院治疗的初发PNS患儿117例和健康对照者97例(鉴于实验中完成所有指标检测需要外周血的体积较大，因此本研究中未采用同一患者及对照者完成各部分实验内容中所有指标的检测)。流式细胞术检测外周血中B细胞发育过程中的亚群：CD19+B细胞，CD27+记忆B细胞，CD27hiCD38hi浆母细胞，CD138+浆细胞，CD27-CD24hiCD38hitransitionalB细胞，CD24+CD38+mature-naiveB细胞和CD38+IgD?GC-like细胞比例，CD19+B细胞上活化及凋亡相关分子CD80,CD86和CD95的荧光表达强度。同时检测CD19+sIgG+B细胞，CD19+cIgG+B细胞，CD19+sIgM+B细胞，CD19+cIgM+B细胞，CD27+sIgG+记忆B细胞和CD38+cIgG+浆细胞水平。凋亡试剂盒AV/PI检测CD19+B细胞的凋亡情况。进一步分析PNS患儿血清中IgG水平与CD27hiCD38hi浆母细胞，CD138+浆细胞，CD19+sIgG+B细胞和CD19+cIgG+B细胞水平的相关性以及CD19+sIgG+B细胞和CD19+sIgM+B细胞，CD19+cIgG+B细胞和CD19+cIgM+B细胞在两组间的相对百分比差异情况。
结果：1.与正常对照组相比，PNS组中CD27hiCD38hi浆母细胞，CD138+浆细胞和CD24+CD38+mature-naiveB细胞显著升高(P＜0.05)，而CD38+IgD?GC-like细胞比例显著下降(P＜0.05)。2.CD19+sIgG+B细胞，CD19+cIgG+B细胞，CD27+sIgG+记忆B细胞和CD38+cIgG+浆细胞水平在PNS组患儿均明显下降(P＜0.05)。3.与正常对照组相比，PNS组CD19+sIgG+B/CD19+sIgM+B和CD19+cIgG+B/CD19+cIgM+B相对百分比均有下降的趋势，但无显著统计学差异(P＞0.05)。4.进一步分析发现，PNS患儿中CD19+sIgG+B细胞和CD19+cIgG+B细胞水平均与血清中的IgG水平呈明显的正相关(r=0.449，P=0.04；r=0.535，P=0.009)，而CD27hiCD38hi浆母细胞和CD138+浆细胞比例均与血清中IgG水平无显著相关性(r=0.174，P=0.348；r=0.289，P=0.088)。5.与正常对照相比，PNS组CD19+B细胞上活化分子CD86的荧光表达强度明显增强(P＜0.05)，而凋亡分子CD95表达水平与AV+PI凋亡比例均无显著差异(P＞0.05)。
结论：原发性肾病综合征患儿体内存在B细胞亚群改变及类别转换后IgG+细胞水平下降，B细胞免疫功能紊乱可能参与了低IgG血症的发生。
第二部分滤泡辅助T细胞在介导儿童原发性肾病综合征B细胞发生免疫球蛋白类别转换障碍中的作用
目的：第一部分实验发现PNS中存在B细胞功能障碍，且与血清低IgG水平相关。目前研究发现，滤泡辅助T细胞(T follicular helper, TFH)在辅助B细胞增值，分化，免疫球蛋白生成方面具有关键作用，故本部分实验旨在探讨TFH细胞是否参与影响PNS患儿B细胞分泌免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)或Ig类别转换障碍的免疫学机制。
方法：流式细胞术检测CD4+CXCR5+TFH细胞及其三个亚群TFH1,TFH2,TFH17细胞比例以及细胞上重要的功能活化分子ICOS表达水平。检测TFH细胞在体外PMA+I+BFA刺激培养下分泌对免疫球蛋白类别转换(Class Switch Recombination，CSR)发生具有重要作用的细胞因子IL-4和IL-21表达水平。同时分别检测TFH细胞和CD19+B细胞重要功能分子CD40L和CD40表达情况。采用荧光定量PCR检测未体外培养下两组AIDmRNA表达情况。进一步设置空白对照组，CD40L刺激组和CD40L+anti-CD40阻断组，体外培养5d后检测AIDmRNA表达情况。
结果：与正常对照组相比，PNS患儿组TFH细胞及其三个亚类TFH1,TFH2,TFH17细胞比例均没有显著差异(P＞0.05)，但所有细胞群体上ICOS表达均显著增高(P＜0.05)。TFH细胞分泌细胞因子IL-4和IL-21在PNS组和正常对照组间无统计学差异(P＞0.05)。与正常对照组比较，PNS组CD19+B细胞上CD40没有变化(P＞0.05)，而TFH细胞上CD40L表达明显下降(P＜0.05)。与正常对照组相比，PNS组外周血的AIDmRNA表达水平在未培养的情况下无差异(P＞0.05)；但体外培养5d后CD40L刺激组PBMC细胞中的AIDmRNA表达水平虽较自身空白组有明显升高(P＜0.05)，但其表达水平仍显著低于正常对照的CD40L刺激组(P＜0.05)。
结论：TFH细胞可能通过CD40-CD40L/AID介导B细胞免疫球蛋白类别转换功能障碍，这可能是儿童PNS低IgG血症的免疫学机制之一。
第三部分RNA-seq寻找儿童原发性肾病综合征中CD19+B细胞DEGs及整合的生物信息学分析
目的：借助生物信息学及高通量测序技术，对PNS患儿和正常对照组儿童纯化的CD19+B细胞进行转录组测序(RNA-seq)分析，以期筛出与B细胞体液免疫功能，特别是与Ig生成以及Ig类别转换紧密相关的关键分子或者信号通路的差异表达基因，并对其进行进一步深入研究。
方法：收集确诊的初发PNS患儿11例和同期招募正常对照儿童11例。采用流式分选仪，纯化分选外周血中的CD19+B细胞，利用Illumina平台高通量转录组测序和R软件内EBSeq2包筛选PNS组和对照组样本中差异表达基因DEGs(Differentially Expressed Genes)。采用TPM标化基因表达量，并进行各样本的基因表达量分布分析。对差异表达基因分别进行聚类分析，GO(Gene Ontology)功能富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析；采用GESA对所有获得的测序数据进行基因集富集分析，STRING数据库对差异表达基因进行蛋白互作网络(Protein-Protein Interaction, PPI)构建并进行可视化以获得核心基因。
结果：各样本中的基因表达量分布一致，适用于后续分析。PNS组和正常对照组共有664个差异表达基因，其中上调有547个，下调有117个(p-adjust<0.05&|log2FC|>=1)。对差异表达基因进行聚类分析发现两组间基因表达模式有较大差异。GO功能富集和KEGG通路富集分析显示，差异表达基因显著富集于B细胞受体信号，激活和与抗原结合力，以及PI3K-Akt和NF-κb信号通路(p-adjust<0.05)。GSEA分析发现IgG记忆细胞和IgM记忆细胞相关基因集以及naive细胞和浆细胞相关基因集与PNS表型紧密相关(|NES|>1&FDRq-val<0.25)。采用PPI分析并进行可视化，找到节点度排名前6位的核心基因，分别为CDK1,PLK1,BUB1,BUB1B,MADIL1和CCNB1，其均参与细胞有丝分裂过程。
结论：测序数据提示B细胞表面受体信号通路在PNS中具有重要意义，同时PI3K-Akt和NF-κb信号通路以及细胞周期参与的免疫球蛋白类别转换事件在后续PNS低IgG血症的机制研究中值得关注。
目的：原发性肾病综合征(Primary nephrotic syndrome, PNS)患儿血清中的IgG水平显著降低，其继发免疫功能低下所致的感染与该病的复发，频复发密切相关。尿中IgG的丢失不能完全解释低IgG血症的发生，提示肾病患儿体内存在分泌免疫球蛋白的B细胞体液免疫功能紊乱。本部分实验目的主要为明确肾病综合征中是否存在B细胞的功能障碍，参与低IgG血症的发生。
方法：于重庆医科大学附属儿童医院肾脏内科收集住院治疗的初发PNS患儿117例和健康对照者97例(鉴于实验中完成所有指标检测需要外周血的体积较大，因此本研究中未采用同一患者及对照者完成各部分实验内容中所有指标的检测)。流式细胞术检测外周血中B细胞发育过程中的亚群：CD19+B细胞，CD27+记忆B细胞，CD27hiCD38hi浆母细胞，CD138+浆细胞，CD27-CD24hiCD38hitransitionalB细胞，CD24+CD38+mature-naiveB细胞和CD38+IgD?GC-like细胞比例，CD19+B细胞上活化及凋亡相关分子CD80,CD86和CD95的荧光表达强度。同时检测CD19+sIgG+B细胞，CD19+cIgG+B细胞，CD19+sIgM+B细胞，CD19+cIgM+B细胞，CD27+sIgG+记忆B细胞和CD38+cIgG+浆细胞水平。凋亡试剂盒AV/PI检测CD19+B细胞的凋亡情况。进一步分析PNS患儿血清中IgG水平与CD27hiCD38hi浆母细胞，CD138+浆细胞，CD19+sIgG+B细胞和CD19+cIgG+B细胞水平的相关性以及CD19+sIgG+B细胞和CD19+sIgM+B细胞，CD19+cIgG+B细胞和CD19+cIgM+B细胞在两组间的相对百分比差异情况。
结果：1.与正常对照组相比，PNS组中CD27hiCD38hi浆母细胞，CD138+浆细胞和CD24+CD38+mature-naiveB细胞显著升高(P＜0.05)，而CD38+IgD?GC-like细胞比例显著下降(P＜0.05)。2.CD19+sIgG+B细胞，CD19+cIgG+B细胞，CD27+sIgG+记忆B细胞和CD38+cIgG+浆细胞水平在PNS组患儿均明显下降(P＜0.05)。3.与正常对照组相比，PNS组CD19+sIgG+B/CD19+sIgM+B和CD19+cIgG+B/CD19+cIgM+B相对百分比均有下降的趋势，但无显著统计学差异(P＞0.05)。4.进一步分析发现，PNS患儿中CD19+sIgG+B细胞和CD19+cIgG+B细胞水平均与血清中的IgG水平呈明显的正相关(r=0.449，P=0.04；r=0.535，P=0.009)，而CD27hiCD38hi浆母细胞和CD138+浆细胞比例均与血清中IgG水平无显著相关性(r=0.174，P=0.348；r=0.289，P=0.088)。5.与正常对照相比，PNS组CD19+B细胞上活化分子CD86的荧光表达强度明显增强(P＜0.05)，而凋亡分子CD95表达水平与AV+PI凋亡比例均无显著差异(P＞0.05)。
结论：原发性肾病综合征患儿体内存在B细胞亚群改变及类别转换后IgG+细胞水平下降，B细胞免疫功能紊乱可能参与了低IgG血症的发生。
第二部分滤泡辅助T细胞在介导儿童原发性肾病综合征B细胞发生免疫球蛋白类别转换障碍中的作用
目的：第一部分实验发现PNS中存在B细胞功能障碍，且与血清低IgG水平相关。目前研究发现，滤泡辅助T细胞(T follicular helper, TFH)在辅助B细胞增值，分化，免疫球蛋白生成方面具有关键作用，故本部分实验旨在探讨TFH细胞是否参与影响PNS患儿B细胞分泌免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)或Ig类别转换障碍的免疫学机制。
方法：流式细胞术检测CD4+CXCR5+TFH细胞及其三个亚群TFH1,TFH2,TFH17细胞比例以及细胞上重要的功能活化分子ICOS表达水平。检测TFH细胞在体外PMA+I+BFA刺激培养下分泌对免疫球蛋白类别转换(Class Switch Recombination，CSR)发生具有重要作用的细胞因子IL-4和IL-21表达水平。同时分别检测TFH细胞和CD19+B细胞重要功能分子CD40L和CD40表达情况。采用荧光定量PCR检测未体外培养下两组AIDmRNA表达情况。进一步设置空白对照组，CD40L刺激组和CD40L+anti-CD40阻断组，体外培养5d后检测AIDmRNA表达情况。
结果：与正常对照组相比，PNS患儿组TFH细胞及其三个亚类TFH1,TFH2,TFH17细胞比例均没有显著差异(P＞0.05)，但所有细胞群体上ICOS表达均显著增高(P＜0.05)。TFH细胞分泌细胞因子IL-4和IL-21在PNS组和正常对照组间无统计学差异(P＞0.05)。与正常对照组比较，PNS组CD19+B细胞上CD40没有变化(P＞0.05)，而TFH细胞上CD40L表达明显下降(P＜0.05)。与正常对照组相比，PNS组外周血的AIDmRNA表达水平在未培养的情况下无差异(P＞0.05)；但体外培养5d后CD40L刺激组PBMC细胞中的AIDmRNA表达水平虽较自身空白组有明显升高(P＜0.05)，但其表达水平仍显著低于正常对照的CD40L刺激组(P＜0.05)。
结论：TFH细胞可能通过CD40-CD40L/AID介导B细胞免疫球蛋白类别转换功能障碍，这可能是儿童PNS低IgG血症的免疫学机制之一。
第三部分RNA-seq寻找儿童原发性肾病综合征中CD19+B细胞DEGs及整合的生物信息学分析
目的：借助生物信息学及高通量测序技术，对PNS患儿和正常对照组儿童纯化的CD19+B细胞进行转录组测序(RNA-seq)分析，以期筛出与B细胞体液免疫功能，特别是与Ig生成以及Ig类别转换紧密相关的关键分子或者信号通路的差异表达基因，并对其进行进一步深入研究。
方法：收集确诊的初发PNS患儿11例和同期招募正常对照儿童11例。采用流式分选仪，纯化分选外周血中的CD19+B细胞，利用Illumina平台高通量转录组测序和R软件内EBSeq2包筛选PNS组和对照组样本中差异表达基因DEGs(Differentially Expressed Genes)。采用TPM标化基因表达量，并进行各样本的基因表达量分布分析。对差异表达基因分别进行聚类分析，GO(Gene Ontology)功能富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析；采用GESA对所有获得的测序数据进行基因集富集分析，STRING数据库对差异表达基因进行蛋白互作网络(Protein-Protein Interaction, PPI)构建并进行可视化以获得核心基因。
结果：各样本中的基因表达量分布一致，适用于后续分析。PNS组和正常对照组共有664个差异表达基因，其中上调有547个，下调有117个(p-adjust<0.05&|log2FC|>=1)。对差异表达基因进行聚类分析发现两组间基因表达模式有较大差异。GO功能富集和KEGG通路富集分析显示，差异表达基因显著富集于B细胞受体信号，激活和与抗原结合力，以及PI3K-Akt和NF-κb信号通路(p-adjust<0.05)。GSEA分析发现IgG记忆细胞和IgM记忆细胞相关基因集以及naive细胞和浆细胞相关基因集与PNS表型紧密相关(|NES|>1&FDRq-val<0.25)。采用PPI分析并进行可视化，找到节点度排名前6位的核心基因，分别为CDK1,PLK1,BUB1,BUB1B,MADIL1和CCNB1，其均参与细胞有丝分裂过程。
结论：测序数据提示B细胞表面受体信号通路在PNS中具有重要意义，同时PI3K-Akt和NF-κb信号通路以及细胞周期参与的免疫球蛋白类别转换事件在后续PNS低IgG血症的机制研究中值得关注。