新蚜虫疠霉(Pandora neoaphidis,Entomophthorales)是虫霉目真菌中最具代表性的蚜科专化性病原真菌,通过主动弹射孢子来侵染蚜虫,从而控制蚜害发生。有研究发现蓝光能显著提高真菌孢子的弹射数量,该特性与光受体密切相关,但新蚜虫疠霉在光受体方面的研究极其缺乏,导致了其流行生态适应性的分子机理理论研究和生防应用方面的潜力受到了极大的限制。本研究以新蚜虫疠霉为研究对象,通过比较在有无蓝光照射条件下孢子弹射的距离及其合速度来探讨蓝光对孢子弹射能力的影响,利用高速显微摄像获得新蚜虫疠霉分生孢子的显微弹射数据并利用MATLAB软件对弹射路径进行拟合;同时利用原核表达系统表达纯化蓝光受体蛋白并进行预测分析它们之间的相互作用能力,最终阐明光照对新蚜虫疠霉分生孢子弹射的影响以及与之相关的蓝光受体蛋白的生物学特性。主要结果如下:一、蓝光对新蚜虫疠霉孢子弹射的影响探究通过测量蓝光照射和黑暗环境条件下新蚜虫疠霉孢子的弹射距离,发现蓝光照射后的新蚜虫疠霉菌丝胶囊弹射出来的分生孢子,无论是在垂直距离还是在水平距离,均高于黑暗条件下的处理。随后对两种不同处理条件下孢子弹射的合速度进行比较分析,发现蓝光照射处理下孢子的合速度显著高于黑暗条件,进一步验证了蓝光对新蚜虫疠霉弹孢能力的积极作用。此外分析计算获得两种处理条件下分生孢子弹射路径的拟合曲线,分别是y=-0.0325x~2+0.207x+0.3132(蓝光照射)和y=-0.0775x~2+0.5316x-0.062(黑暗条件)。二、新蚜虫疠霉孢子弹射动态观察及路径预测利用高速显微摄像,成功拍摄到新蚜虫疠霉孢子弹射视频,并利用高速相机视频处理软件i-SPEED Suit对其进行速度计算。当孢子状态良好并处于湿度较高环境时,其弹射速度能达到2.07 m/s;而当孢子所处环境湿度、温度均未达到适宜条件时,其弹射速度有所下降,在弹射初期,速度为0.1365 m/s,而后由于空气黏度的原因,速度逐渐减慢至1.052×10~-33 m/s。此外,在已知孢子物理参数(弹射角度、质量、大小等)的基础上通过使用MATLAB软件对孢子弹射路径进行了拟合,拟合曲线为y=-9199.3x~2+0.8624x+0.00008,拟合优度为R~2=0.8941。三、蓝光受体蛋白PnWC-1和PnWC-2的原核表达通过转录组数据及RACE克隆技术,获得了pnwc-2 cDNA的全长序列,并对该基因进行了初步的生物信息学分析,发现该基因的蛋白结构域与其他物种有较大的相似度,但进化树分析表明pnwc-2为单独的一类。随后利用本实验室前期已获得的pnwc-1基因体外表达PnWC-1蛋白,分别构建了以pET-28a为载体的重组质粒pET-wc-1和以pCold-TF为载体的重组质粒pCold-wc-1,并筛选诱导表达最佳条件。表达结果显示,重组蛋白pET-wc-1诱导表达后目的蛋白为包涵体;而使用pCold-wc-1重组蛋白表达,目的蛋白则为可溶性蛋白。此外,构建了pCold-wc-2重组载体,低温诱导表达获得重组蛋白PnWC-2,且目的蛋白为可溶性蛋白。四、蓝光受体蛋白PnWC-1和PnWC-2互作模拟分析根据pnwc-1和pnwc-2的氨基酸序列,预测到二级结构中无规卷曲占比较高,其次是α-螺旋,延伸链和β-折叠比例较低;利用两个蛋白的氨基酸序列,使用PPA-Pred预测互作过程中的ΔG(结合自由能)为-11.73 kcal/mol,解离常数Kd为2.51e-09 M;还利用SWISS-MODEL进行两个蛋白的三级结构预测,并以该两个三级结构为模型,进行分子对接模拟,发现两个蛋白的相互作用面积为1072.7?~2,该方式互作产生的自由能Δ~iG为-12.2 kcal/mol,且在互作过程中,发现有5个氨基酸位点会形成氢键。