论文部分内容阅读
苯丙酮尿症（Phenylketonuria,PKU）是一类由于体内苯丙氨酸（Phenylalanine,Phe）代谢异常而导致的疾病,呈常染色体隐性遗传。PKU在世界范围内分布广泛、发病率高,会严重影响患者的认知和心理。目前PKU患者主要通过饮食疗法控制病情,这种方式不仅降低了患者的生活质量,也给社会带来极大的经济负担。因此,临床上需要新的治疗方法。部分PKU患者的病因来自苯丙氨酸羟化酶（Phenylalanine hydroxylase,PAH）的无义突变,这种突变类型在某些实验中可以被新型化合物PTC124矫正。本实验通过构建相关载体,对转染无义突变PAH基因的细胞进行PTC124处理并检测其在转录和翻译水平上的变化,探索了PTC124对PAH无义突变类型Y356XPAH和W326XPAH在表达过程中的矫正效果,以期为PKU的治疗提供新策略。1、构建相关载体本实验利用基因工程技术,成功构建6个真核表达载体。一类是带有红荧光标记的pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-Y356XPAH和pCMV-DsRed-W326XPAH,另一类是带有G418标记的pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-Y356XPAH和pcDNA3.1-W326XPAH。2、体外表达系统的确定通过查阅文献选择HEK293细胞实现载体基因的表达。购买细胞株后通过常规的细胞培养技术对细胞进行扩培,并对其mRNA进行初步分析,未检测出PAH基因的表达,证明HEK293细胞符合实验要求。3、载体的转染及细胞筛选本实验采用脂质体转染的方式将载体基因分别导入HEK293细胞。对转染了pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-Y356XPAH和pCMV-DsRed-W326XPAH的细胞进行流式细胞仪检测,转染效率达到72%。对转染了pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-Y356XPAH和pcDNA3.1-W326XPAH的细胞进行G418筛选,存活细胞即为阳性细胞。4、PTC124浓度的确定分别用浓度为0μM、50μM、100μM和200μM的PTC124处理HEK293细胞,再对其进行细胞活力、细胞周期、细胞凋亡和细胞增殖分析。发现浓度为50μM和100μM的PTC124对细胞是相对安全的,浓度为200μM的PTC124对细胞活性和细胞增殖都有消极影响,还会将细胞阻滞在S期,同时促进细胞凋亡。最后选择100μM为后续实验中PTC124的处理浓度。5、各实验组的检测使用载体pCMV-DsRed-PAH、pCMV-DsRed-Y356XPAH、pCMV-DsRed-W326XPAH、pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-Y356XPAH和pcDNA3.1-W326XPAH分别对HEK293细胞进行脂质体转染,然后将其分成两部分:对照组是转染PAH基因的细胞,进行正常的细胞培养;实验组是转染了无义突变PAH基因的细胞,一部分进行普通培养,另一部分用浓度为100μM的PTC124处理。48h后分别对上述细胞进行qPCR和Western Blot检测。qPCR实验表明,各实验组均表达了PAH。PAH无义突变基因的表达量经矫正培养后明显高于普通培养,但仍低于转染PAH基因的表达量。Western Blot实验表明,各实验组都成功表达了PAH蛋白。经矫正培养后无义突变实验组产生的PAH增多。利用酶活性实验检测野生型和无义突变PAH的活性。分别利用pcDNA3.1-PAH、pcDNA3.1-Y356XPAH和pcDNA3.1-W326XPAH载体转染细胞,转染了PAH基因的细胞正常培养,作为阳性参照。转染了PAH无义突变基因的细胞分别经过普通培养和矫正培养。实验发现,转染野生型PAH基因的细胞合成了有活性的PAH;转染了pcDNA3.1-Y356XPAH和pcDNA3.1-W326XPAH的细胞中,经过普通培养的未检测到活性PAH,经过PTC124矫正后细胞合成了有活性的PAH;与转染野生型PAH基因的细胞相比,转染载体pcDNA3.1-Y356XPAH的活性达到了19%,转染载体pcDNA3.1-W326XPAH的活性达到了13%。综上所述,PTC124在PAH突变基因Y356XPAH和W326XPAH的表达过程中可以发挥矫正作用,使之能够合成有活性的PAH蛋白。