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目的掌握大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow derived Mesenchyal Stem Cells,BM-MSCs)的提取及培养方法,研究BM-MSCs对平衡的影响,为MSCs应用于临床器官移植相关并发症的治疗提供一定的理论依据。方法提取Wistar大鼠股骨及胫骨中的BM-MSCs并传代培养,通过细胞形态学、流式表型及体外诱导成脂、成骨分化对培养的细胞进行鉴定;提取Wistar大鼠脾单个核细胞,经磁珠分离法获得CD4+T淋巴细胞;将CD4+T淋巴细胞与BM-MSCs于不同条件下混合培养,混合培养结束后,通过流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞中的比例,并通过微量样本多重蛋白定量技术(CytometricBead Array,CBA)检测培养液中特定细胞因子的含量。结果分离培养并传代BM-MSCs后,细胞形态呈星形或梭形,流式细胞仪检测高表达表型CD90、CD29阳性率>95%,低表达表型CD45阳性率<5%;体外诱导条件下具有成骨分化及成脂肪分化的潜能。磁珠分离筛选的CD4+T淋巴细胞,流式结果示CD4阳性率>95%。BM-MSCs与CD4+T细胞混合培养后:(1)BM-MSCs的浓度在0.5倍基础浓度时对Th17的增殖有促进作用,而在4倍浓度时可以抑制Th17的增殖;IL-17和IL-6的分泌未受影响。Treg的比例并未受BM-MSCs影响,IL-10的水平在2倍基础浓度的BM-MSCs的条件下高于0.5倍浓度,TGF-β的水平则未受影响。(2)在TGF-β阻断剂条件下,各组间Th17比例未现明显统计学差异,IL-17的水平在高浓度阻断剂条件下浓度为(5.525±1.437)pg/m L,高于空白对照组的13.905(12.570,14.670)pg/mL(P<0.05);高浓度组IL-6水平为32.030(23.635,37.853)pg/mL,高于空白对照组,同时高于低浓度组的13.905(12.570,14.670)pg/m L(P<0.05);各浓度组Treg比例均低于对照组(P<0.05)。高浓度TGF-β阻断剂条件下IL-10的水平(610.95±226.67)pg/mL,高于低浓度组和空白对照组(P<0.05)。在IL-2阻断剂条件下,Th17的比例在高浓度组低于低浓度组和对照组(P<0.05)。Treg的比例在高浓度的IL-2阻断剂条件下较对照组显著降低(P<0.05)。(3)在应用他克莫司的条件下,各组间Th17的比例均无明显统计学差异。IL-17、IL-6在加入了他克莫司的培养组中均低于对照组。Treg的比例在高浓度与低浓度组中较空白对照组均有降低(P<0.05)。IL-10在应用他克莫司后较对照组均出现升高(P<0.05)。在雷帕霉素的条件下,Th17细胞在实验组所占的比例低于对照组(P<0.05)。IL-17的水平在应用了高浓度雷帕霉素组低于空白对照组(P<0.05),IL-6的水平在应用了雷帕霉素后高于对照组(P<0.05)。Treg的比例在应用了不同浓度雷帕霉素后均高于对照组(P<0.05),同时IL-10较对照组降低(P<0.05),但是不同浓度雷帕霉素组间并无差异。结论(1)BM-MSCs对Th17的分化调节作用与干细胞的浓度存在相关性,但不能影响IL-17和IL-6的分泌;对Treg及TGF-β的正性调节无浓度相关性,但是对IL-10的分泌有促进作用。(2)阻断TGF-β受体可以降低BM-MSCs对Treg分化的促进作用,但是对Th17的比例并无影响。同时使BM-MSCs对IL-17、IL-10和IL-6的抑制作用降低。阻断IL-2可以有效地抑制Treg的增殖和分化,同时Th17的比例也有降低,IL-17的表达可以受到强烈的抑制。此外,IL-10、IL-6和TGF-β的表达不受IL-2的调控。(3)他克莫司条件下,BM-MSCs对Th17的抑制作用并未受到影响,但是对IL-17表达的抑制作用得到了增强,同时Treg的增殖受到抑制,促进了IL-10分泌的作用。在应用雷帕霉素后,BM-MSCs抑制Th17的增殖的作用增强,同时,IL-17的表达被强烈抑制。此外,雷帕霉素可以增强BM-MSCs促进Treg分化的能力,但是会抑制IL-10的分泌。