雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)属于核受体超家族的一员,参与多种生理学和病理学过程。雌激素结合活化的ERα可形成同源二聚体,与回文的雌激素反应元件(estrogen response element,ERE)结合,发挥转录激活的功能。ERα主要包含3个重要的结构域,分别是AF1结构域、AF2结构域和DBD结构域。AF1和AF2都是转录激活结构域,但只有AF2结构域具有雌激素依赖性。DBD结构域主要介导ERα与DNA序列的相互作用。乳腺癌作为女性发病率最高的恶性肿瘤之一,具有十分复杂的发病机制。目前认为,人体内分泌水平的异常是诱发乳腺癌的一个重要原因。约3/4的乳腺癌为ERα阳性,而ERα的过度活化能够刺激正常细胞的恶性转化,也是维持乳腺癌细胞增殖的一个必要条件。ERα与配体和共调节因子结合的失调以及自身结构和翻译后化修饰的变化都会不同程度地影响雌激素受体的信号通路,参与乳腺癌的发生发展。因此,ERα是乳腺癌的生物标记物,常用于指导乳腺癌的治疗。目前,靶向ERα是乳腺癌辅助治疗中最常用的策略之一。Tamoxifen是ERα的一个经典拮抗剂,通过与雌激素竞争结合ERα,抑制ERα的活性,抑制乳腺癌细胞的生长和增殖。同时,ERα共调节因子的丰度和/或活性的异常往往与乳腺癌的发生率和致死率具有相关性,也是预测和治疗乳腺癌的潜在靶标,因此对ERα调节蛋白的研究对揭示ERα的调控机制,鉴定乳腺癌的诊断和治疗靶标具有重要的意义。C2H2型锌指蛋白家族是哺乳动物中最大的转录/转录调控因子家族,而KRAB型锌指蛋白只存在于四足脊椎动物中,具有相似的结构和作用机制,且随着物种进化数量急剧增加,在人类基因组中数量高达423种,占据了C2H2型锌指蛋白总数的60%左右。KRAB型锌指蛋白N端的KRAB结构域通过与KAP1相互作用招募转录抑制蛋白,形成转录沉默复合物,发挥转录抑制的功能,而C端的C2H2型锌指结构域主要介导与特定DNA序列或其他转录因子的结合,将转录沉默复合物锚定在特定染色质位点。越来越多的证据表明,KRAB型锌指蛋白的出现和数量膨胀与脊椎动物的进化及其精细转录调控网络的建立和完善密切相关。KRAB型锌指蛋白参与稳定基因组结构、胚胎发育、细胞的增殖和分化等正常生理活动,又与肿瘤的发生发展有某些关联。一般情况下,癌细胞中转录调控网络趋于简单化,而癌组织中KRAB型锌指蛋白的丰度也往往低于癌旁组织。ZNF496属于KRAB型锌指蛋白,可通过其C2HR结构域与NSD1(nuclear receptor binding SET domain protein 1)结合,介导KAP-1不依赖的转录抑制功能。目前,尚未有关于ZNF496功能及机制的详细报道。通过www.proteinatlas.org网站对其表达谱分析,发现ZNF496在女性生殖系统和乳腺中高表达,但是在相应的癌组织中表达很少或不表达,提示ZNF496可能与乳腺癌的发生发展有关联,但是其中的机制尚不明确。我们的研究发现:1、ZNF496在女性乳腺和生殖系统中高表达,在相应的癌组织中低表达。我们通过购买的人类生殖系统肿瘤组织芯片发现,ZNF496在乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌中的表达低于癌旁组织。我们还通过WB检测了成年雄鼠和雌鼠的主要组织器官中ZNF496的相对表达丰度。结果显示ZNF496在肺、卵巢、输卵管和子宫中特异性表达。ZNF496的这种组织特异性表达可能与这些组织器官的正常生理功能的维持相关。2、ZNF496能够与ERα相互作用:为了探讨ZNF496的功能机制,我们首先通过IP-MS鉴定MCF-7细胞核中ZNF496的潜在相互作用蛋白,质谱结果显示ERα可能是ZNF496潜在的相互作用蛋白。随后的Co-IP证实,无论E2是否存在,ZNF496均能够与ERα发生相互作用。3、ZNF496选择性抑制ERα的转录活性:qPCR实验证实,在E2处理条件下,ZNF496的过表达能够抑制,敲低能够促进ERα靶基因Greb1、pS2、Xbp1、Sgk1和Wisp2的转录水平,而对ERα另一个靶基因Serpina3的表达没有影响,同时ZNF496并不影响ERα的mRNA和蛋白水平。这说明了ZNF496能够选择性调控ERα的转录活性。4、ZNF496选择性抑制ERα与部分靶基因启动子的结合:实验室他人工作证实ZNF496蛋白C端的C2H2型锌指结构域和ERα蛋白中部的DBD结构域介导了它们之间的相互作用,提示ZNF496可能影响ERα与ERE区的结合。荧光定位实验证实,在E2处理条件下,ZNF496的过表达减弱活化的ERα在核内的凝集现象。为了探讨ZNF496选择性调控ERα的机制,我们开展了EMSA实验。结果显示,在E2处理条件下,随着ZNF496表达量的增加,ERα结合ERE序列的能力逐渐减弱。进一步提示,在E2处理条件下,ZNF496的过表达能够抑制ERα与ERE序列的结合。最后我们利用Ch IP-qPCR实验检测MCF-7中内源ERα与其靶基因启动子区域的结合能力。结果显示,在E2处理条件下,ZNF496过表达之后,ERα结合pS2、Greb1和Wisp2等基因启动子的能力出现减弱趋势,而ERα结合Serpina3启动子的能力没有变化。5、ZNF496可抑制ERα阳性乳腺癌细胞的增殖:利用慢病毒感染,获得ZNF496稳定过表达的细胞株MCF-7、T-47D和MDA-MB-231。CCK-8测细胞增殖实验显示,在E2处理条件下,ZNF496过表达能够抑制MCF-7和T-47D的增殖,而对MDA-MB-231没影响。克隆形成实验也证实,在正常培养基培养条件下,ZNF496过表达能够抑制MCF-7和T-47D的克隆形成能力,而对MDA-MB-231没影响。因此,ZNF496通过选择性抑制ERα的活性抑制ERα阳性乳腺癌细胞的增殖。6、ZNF496在乳腺癌中的差异表达依赖于ERα的状态:29例乳腺癌病例样本的免疫组化结果显示,ZNF496在癌组织中的表达显著低于癌旁组织。当我们将乳腺癌样本划分为ERα+和ERα-时,ZNF496在ERα+乳腺癌组织中的表达极显著低于癌旁组织,而ZNF496在ERα-乳腺癌组织中的表达与癌旁组织没有显著性差异。因此ZNF496在乳腺癌中的差异表达依赖于ERα的阳性表达。综上所述,本研究发现ZNF496通过竞争结合ERα的DBD结构域选择性抑制ERα与ERE区的结合,降低ERα的转录活性。ZNF496依赖对ERα的调控发挥抑制ERα阳性乳腺癌细胞增殖的作用。本研究为进一步揭示ERα阳性乳腺癌发生发展的分子机理提供了思路,为乳腺癌的诊断或治疗提供了潜在靶标,同时完善了人们对KRAB型锌指蛋白家族成员功能与作用机制的认识。