斑马鱼生长抑素转基因载体构建及启动子活性分析

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生长抑制激素是一类肽类激素,也称之为生长激素抑制激素以及生长激素释放抑制因子,它能调节内分泌系统而且通过与G蛋白偶联的生长抑素受体来影响神经传递及细胞增生。生长抑素通过选择性剪接前蛋白原形成有两种活性形式:一种是14氨基酸,另一种是28个氨基酸。硬骨鱼中包含有6个不同的生长抑素基因并被分别命名为ss1、ss2、ss3、ss4、ss5、ss6,六种不同的配体基因以及多种不同的受体使得生长抑素的作用十分广泛。斑马鱼生长抑素1主要在中枢神经系统以及胰脏中表达,本研究以Tol2转座子技术为依托,通过Gateway技术,成功地将ss1与遍在表达的启动子及EGFP荧光报告基因重组到一个包含有可被Tol2转座酶识别序列的载体中,通过将这一重组载体(100ng/ul)与体外转录出来的Tol2 mRNA(100ng/ul)按1:1比例共注射到1-2细胞期的斑马鱼胚胎细胞中来分析其瞬时表达模式,而对照组只注射50ng/ul的质粒,发现:在CMV/SP6遍在表达启动子的作用下,EGFP绿色荧光在斑马鱼胚胎中呈现全身性表达;挑选了24hpf发荧光的胚胎对数据进行统计分析发现:Tol2 mRNA与质粒共注射的斑马鱼胚胎中绿色荧光约占56.79%左右,而只注射重组质粒的胚胎这一效率有大约27.45%:只注射质粒的对照组胚胎EGFP的表达模式为嵌合型表达,而共注射组则更倾向于片状或带状表达;3dpf时质粒对照组和共注射组荧光胚胎占分别占5.54%和34.08%,这说明共注射组表达更稳定。生长抑素4主要在内分泌胰脏以及胚胎早期发育过程中的底板中表达。借助于生物信息学软件分析斑马鱼ss4翻译起始位点上游2467bp的核苷酸序列中对其表达调控起作用的潜在顺式作用元件。我们发现在斑马鱼ss4可能参与肝胰脏发育、心血管形成等生命过程。我们克隆了这段区域并将其分为长度大小不等的五段分别亚克隆到pGL3-basic vector中,然后将其转染HepG2细胞,利用Promega双荧光报告检测试剂盒来检测不同启动子活性的强弱。以翻译起始位点A+1 TG为参照,我们发现翻译起始位点上游-2200bp左右处存在核心启动子,上游-1000bp至-2000bp范围内可能存在对其活性有抑制作用的元件,在上游-500bp处可能存在起促进作用的元件。
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