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第一部分肠凝集素1上调神经母细胞瘤中NDRG2的表达水平目的:探寻神经母细胞瘤中肠凝集素1调节的关键下游基因,并在神经母细胞瘤细胞株中检测ITLNI对其转录及蛋白表达水平的影响。方法:通过综合分析ITLN1在R2基因可视化芯片数据库中的多个大样本芯片数据,查找ITLN1在神经母细胞瘤中调节的关键下游基因,同时通过实时定量PCR、双荧光素酶报告基因检测及蛋白免疫印迹(Western-blot)等实验方法检测其在神经母细胞瘤细胞株中对该下游基因转录活性及表达水平的影响。结果:多数据库综合分析显示转录因子NDRG2可能为ITLN1调控的关键下游基因,实时定量PCR检测证实在神经母细胞瘤细胞株中NDRG2是ITLN1的下游基因。ITLN1可以显著上调NDRG2启动子报告基因的活性(1.88倍,p<0.05),并可显著上调NDRG2转录水平(15.23倍,p<0.05)及蛋白水平(6.25倍,p<0.01)。而敲低ITLN1可显著下调NDRG2启动子报告基因活性(0.47倍,p<0.05),并可显著下调NDRG2转录水平(0.33倍,p<0.05)及蛋白水平(0.24倍,p<0.01)。此外,NDRG2下游基因血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶9的表达水平也在加入重组ITLN1蛋白刺激(0.23倍/0.28倍,p<0.01)及过表达ITLN1的瘤细胞中显著降低(0.17倍/0.15倍,/p<0.01)。结论:ITLN1在神经母细胞瘤中能促进NDRG2的转录活性及表达水平。第二部分转录因子KLF4介导肠凝集素1对NDRG2表达的调控作用目的:探究神经母细胞瘤中调节NDRG2的关键转录因子,并在神经母细胞瘤细胞株检测其对NDRG2转录及蛋白表达水平的影响。方法:通过综合分析NDRG2在R2基因可视化芯片数据库中神经母细胞瘤88例芯片数据,结合对NDRG2启动子序列的Genomatix软件分析,确定调节NDRG2的关键转录因子。通过实时定量PCR、双荧光素酶报告基因检测及Western-blot、染色质免疫共沉淀等实验方法,证实该转录因子在神经母细胞瘤细胞株中调控NDRG2转录活性及表达水平。结果:R2基因可视化芯片数据库分析显示在神经母细胞瘤中,KLF4是调节NDRG2的关键转录因子。KLF4可以显著上调NDRG2启动子报告基因的活性(6.89倍,p<0.05),并可显著上调NDRG2转录水平(7.31倍,p<0.05)及蛋白水平(3.42倍,p<0.01)。而敲低KLF4可显著下调NDRG2启动子报告基因活性(0.27倍,p<0.05),并可显著下调NDRG2转录水平(0.23倍,p<0.05)及蛋白水平(0.18倍,p<0.01)。此外,染色质免疫共沉淀实验证实,KLF4能直接结合于NDRG2启动子上相应位点。结论:KLF4在神经母细胞瘤中结合于NDRG2启动子并调控其转录活性及表达水平。第三部分肠凝集素1通过PI3K/AKT信号通路调控KLF4活性目的:探究神经母细胞瘤中ITLN1调节KLF4的机制,明确ITLN1是通过何种信号通路来调节KLF4水平。方法:通过综合分析已有的报道KLF4的文献,结合信号通路上关键蛋白的Western-blot,观测ITLN1是否通过PI3K/AKT信号通路在神经母细胞瘤细胞株中调控KLF4的表达水平。结果:ITLN1能上调神经母细胞瘤细胞中KLF4的蛋白水平但是不改变其转录水平:ITLN1过表达时,瘤细胞中PI3K/AKT信号通路上的关键磷酸化蛋白Thr308和S473 降低(0.12 倍/0.24 倍,p<0.01),同时 KLF4 水平上升(5.24 倍,p<0.01);敲低ITLN1时,瘤细胞中PI3K/AKT信号通路上的关键磷酸化蛋白Thr308和S473升高(3.35 倍/4.77 倍,p<0.01),同时 KLF4 水平下降(0.16 倍,p<0.01)。进一步用 PI3K特异性抑制剂LY294002处理瘤细胞后,ITLN1所起到的调控作用被抵消(p<0.05)。结论:在神经母细胞瘤ITLN1通过PI3K/AKT信号通路调控KLF4表达水平,进一步调控NDRG2的水平。第四部分肠凝集素1抑制神经母细胞瘤的增殖、侵袭和转移目的:探讨ITLNI通过靶向调节NDRG2基因启动子活性及蛋白表达,在体内外对神经母细胞瘤细胞的增殖、侵袭和转移的影响,为研究ITLN1的生物学功能奠定实验基础。方法:建立并筛选稳定过表达/敲低ITLN1的神经母细胞瘤细胞株,通过MTT试验、划痕迁移实验、基质胶侵袭实验、克隆形成实验等体外实验方法检测神经母细胞瘤细胞增殖、侵袭及转移活性。通过建立神经母细胞瘤裸鼠皮下成瘤、裸鼠体内实验性转移瘤动物模型,评估过表达/敲低ITLN1对瘤细胞体内增殖、侵袭、转移活性的影响。结果:与对照组相比,过表达ITLN1能降低神经母细胞瘤增殖活性,并减弱神经母细胞瘤细胞的侵袭活性及转移活性(p<0.05);而敲低ITLN1的细胞株表现出较高的增殖及侵袭、转移活性(p<0.05)。体内实验显示,裸鼠的神经母细胞瘤移植瘤模型与对照组相比,ITLN1过表达能减少神经母细胞瘤裸鼠的肿瘤体积(p<0.05)、瘤体重量(p<0.05),稳定转染ITLN1的神经母细胞瘤细胞裸鼠血行转移模型中,肺转移肿瘤灶显著减少(P<0.05);而敲低ITLN1的裸鼠血行转移模型中,肺转移肿瘤灶显著增加(p<0.05)。结论:ITLN1能调控肿瘤的增殖、侵袭和转移活性,在体外和体内抑制神经母细胞瘤细胞的生物学活性。第五部分神经母细胞瘤组织标本及细胞株中肠凝集素1的表达分析目的:对神经母细胞瘤组织标本及数种细胞系中ITLNI及NDRG2的蛋白表达水平进行检测,进一步明确ITLNI及NDRG2的表达水平与肿瘤进展及患儿预后的相互关系。方法:取正常背根神经节细胞标本及肿瘤组织、细胞标本,采用免疫组织化学染色、实时定量PCR及Western-blot等方法检测所收集标本及细胞株中ITLN1、NDRG2的表达水平,取用R2数据库中的神经母细胞瘤88例组织标本转录表达谱芯片进行ITLNI与NDRG2表达相关性的分析,并进行ITLN1与NDRG2的对于患儿生存的相关性Kaplan-Meier分析结果:免疫组织化学法检测所收集42例神经母细胞瘤临床标本中ITLN1及NDRG2的表达状况,ITLN1蛋白主要表达于细胞浆中,NDRG2表达在细胞核,并且ITLN1与NDRG2蛋白表达呈一致关系。共在14例(33.3%)NB临床标本中检测到ITLN1蛋白的表达。年龄小于一岁(p=0.03)、分化较好(p<0.001)、核分裂指数较低(p=0.002)、INSS(International Neuroblastoma Staging System)分级较低(p=0.003)的NB组织标本中ITLN1蛋白的表达水平更高。在神经母细胞瘤组织和细胞株中,ITLN1和NDRG2的蛋白表达水平较正常背根神经节对照组降低。R2芯片可视化数据库的Kaplan-Meier生存分析显示:高表达的ITLN1(p=0.025)和高表达的NDRG2(p=0.0015)均对神经母细胞瘤患者的生存有利。结论:神经母细胞瘤组织标本及细胞株中ITLN1与NDRG2蛋白表达水平呈显著正相关,高表达ITLN1与NDRG2的肿瘤预后较好。