子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)简称为内异症,是指具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔以外的身体其他部位,是一种严重影响妇女身心健康和生活质量的妇科常见疾病。其中不孕和疼痛是内异症的主要临床症状。内异症疼痛往往表现为痛经、性交痛、排尿痛、排便痛及慢性盆腔疼痛等。研究认为,内异症是一种雌激素依赖的慢性炎症性疾病。但临床治疗中抗炎药物往往疗效不佳,而降低雌激素类药物如GnRHα治疗内异症疼痛虽然有效,但存在严重的低雌激素副作用和停药后复发等问题。手术切除内异病灶也不能有效消除内异症患者的疼痛症状。因此,深入探究内异症疼痛的发生发展机制,寻找新的治疗方法显得必要而紧迫。近年来研究发现,内异症病灶中存在感觉神经纤维的异常分布及特异性伤害感受器受体(如TRPV1)的高表达,且与患者表现的疼痛症状相关。深部浸润型(DIE)内异症患者的内异病灶中,感觉神经纤维的分布密度较其他类型的内异病灶丰富,与该型患者所表现出的严重的盆腔疼痛症状相关,提示内异症的疼痛可能与内异病灶中神经纤维的浸润有关。病灶中的炎症因子(如IL-1β,TNF-α)及感觉神经末梢释放物(如SP)可以刺激感觉神经纤维使其产生神经冲动,从而使外周神经敏化,经背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)传入中枢,造成患者的疼痛症状。因此,内异症疼痛可以认为是一种炎症性神经病理性疼痛。三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)是细胞内最重要的能量分子,同时ATP及其他核苷酸类似物也是细胞间的信号传导分子。在生理和病理情况下,ATP及核苷酸类似物可以由不同细胞分泌,作用于其广泛分布于身体各个器官和组织上的受体,参与机体反应。根据这些受体结构和功能的不同,可以将受体分为P1型(A1,A2A,A2B,A3),P2X 型(P2X1-7)和 P2Y 型(P2Y1,P2Y2,P2Y4,P2Y6,P2Y11-14)。其中 P2X3(P2X ligand-gated ionchannel 3)受体特异性表达在上皮细胞和感觉神经元上,且受体的高表达和激活可以导致慢性疼痛模型动物的痛觉敏化,提示P2X3受体在神经病理性疼痛敏化及信号传递中发挥了重要作用。然而P2X3受体是否参与,以及如何参与内异症疼痛仍缺少相关文献报道。本研究首先应用荧光素-荧光素酶法测定子宫内膜中ATP含量,结果发现内异症异位内膜组织中ATP含量显著高于其在位子宫内膜组织和非内异症子宫内膜组织。RT-qPCR,Western Blot和免疫组织化学结果发现P2X3受体在内异症异位子宫内膜组织和在位子宫内膜组织中的表达水平显著高于非内异症在位子宫内膜组织,且与患者的疼痛严重程度呈正相关。体外纯化并培养异位子宫内膜间质细胞,发现IL-1β可以刺激离体异位子宫内膜间质细胞释放ATP,同时,IL-1β和ATP的干预均可以激活MAPK/ERK/CREB信号通路,导致P2X3受体mRNA和蛋白水平的表达增加。然后建立内异症大鼠模型,在内异症大鼠模型中发现,内异症病灶和DRG组织中ATP的释放量增加,P2X3受体表达水平上调,且与模型大鼠的疼痛行为改变相关。在来源于大鼠的DRG细胞系中发现,ADP的干预可以引起ATF3/AP-1通路的激活和P2X3受体表达增加,且能被ATF3 siRNA所抑制。最后我们设计应用脂质纳米材料壳聚糖硬脂酸/脂质体(CSOSA/LPs)包装的ATF3/AP-1通路抑制剂SP600125,在DRG细胞和内异症大鼠模型中有效抑制了 ADP介导的P2X3受体的表达上调及内异症所致的大鼠疼痛敏化。上述结果为进一步了解内异症的疼痛机制,寻找内异症疼痛的靶向治疗药物提供了新的方向和思路。第一部分:内异症病灶中ATP含量和P2X3受体的表达水平及与患者疼痛症状的关系目的:研究ATP和P2X3受体在内异症异位、在位子宫内膜以及非内异症患者子宫内膜组织中的表达水平,并分析其表达水平与内异症患者疼痛严重程度的相关性。方法:根据入组标准收集新鲜的内异症患者异位内膜,在位内膜以及非内异症患者的在位子宫内膜组织标本;应用荧光素-荧光素酶的方法检测子宫内膜组织中ATP的含量;应用RT-qPCR,Western Blot和免疫组化的方法检测子宫内膜组织中P2X3受体mRNA和蛋白的表达水平;应用免疫荧光双染法测定内异症病灶中CGRP与P2X3受体的共表达情况。结果:1.内异症异位子宫内膜组织中ATP含量显著高于内异症在位子宫内膜和非内异症在位子宫内膜组织;内异症病灶中的ATP含量与患者的疼痛相关。2.P2X3受体主要表达于异位子宫内膜病灶中的子宫内膜腺上皮和浅表上皮细胞,但也可表达在子宫内膜间质细胞;内异症患者异位子宫内膜组织和在位子宫内膜组织中P2X3受体mRNA和蛋白的表达水平显著高于非内异症在位子宫内膜组织,且与患者的疼痛严重程度呈正相关。3.内异症病灶中CGRP和P2X3受体存在共表达。结论:1.内异症病灶中ATP含量和P2X3受体表达上调可能参与内异症疼痛的发生。2.内异症病灶CGRP染色的感觉神经纤维中存在P2X3受体表达预示内异症存在外周敏化。第二部分:ATP和IL-1β通过MAPK/ERK/CREB通路促使异位子宫内膜间质细胞P2X3受体表达上调目的:测定内异症异位、在位子宫内膜间质细胞ATP含量和P2X3受体表达水平并与非内异症在位子宫内膜间质细胞比较,研究异位子宫内膜间质细胞中ATP含量和P2X3受体表达及相应分子调控机制。方法:收集新鲜的内异症患者异位内膜组织,在位内膜组织以及非内异症患者的在位子宫内膜组织标本,分离并纯化子宫内膜间质细胞进行体外培养;用荧光素-荧光素酶的方法检测子宫内膜间质细胞中ATP的含量;用RT-qPCR,Western Blot检测子宫内膜细胞P2X3受体的mRNA和蛋白表达水平;IL-1β干预异位内膜间质细胞,检测细胞ATP的释放水平;分别应用IL-1β和ATP干预异位内膜细胞,检测P2X3受体在mRNA和蛋白水平的变化及MAPK通路关键分子变化,同时应用MAPK/ERK通路特异性抑制剂PD98059,重复上述干预。结果:1.内异症异位子宫内膜间质细胞中的ATP含量,P2X3受体的mRNA和蛋白表达水平显著高于内异症在位子宫内膜间质细胞和非内异症在位子宫内膜间质细胞。2.IL-1β可促进内异症异位子宫内膜间质细胞释放ATP。3.IL-1β和ATP可通过激活MAPK/ERK/CREB分子信号通路,上调异位子宫内膜间质细胞的P2X3受体mRNA和蛋白的表达,这种效应被该信号通路特异性抑制剂PD98059所抑制。结论:1.IL-1β与ATP可通过激活MAPK/ERK/CREB信号通路上调内异症离体异位子宫内膜间质细胞P2X3受体的表达水平。2.IL-1β可能通过刺激内异症异位子宫内膜间质细胞释放ATP以及上调异位子宫内膜间质细胞P2X3受体的表达,从而参与内异症疼痛的产生。第三部分:子宫内膜异位症大鼠模型病灶与大鼠DRG组织ATP含量和P2X3受体的表达与模型大鼠疼痛行为学改变的相关性目的:研究子宫内膜异位症大鼠模型异位子宫内膜病灶与DRG组织中ATP释放量和P2X3受体的表达水平与模型大鼠疼痛行为学的相关性。方法:应用自体移植内膜的方法建立SD大鼠内异症模型,并在术前和术后每周检测大鼠模型对热和机械刺激的疼痛行为改变情况;应用荧光素-荧光素酶,RT-qPCR,Western Blot和免疫组化方法检测大鼠内异症模型异位子宫内膜病灶和DRG组织中ATP的释放量及P2X3受体的表达水平;比较分析ATP释放量和P2X3受体表达水平与内异症大鼠疼痛行为改变的相关性。结果:1.内异症大鼠模型造模后3周对热刺激和机械刺激反应强度显著高于对照组大鼠,至造模6周,内异症模型大鼠对热和机械反应强度持续增加,呈现出显著的相关性。2.P2X3受体主要表达内异症大鼠模型异位子宫内膜病灶的浅表上皮细胞和DRG组织中的中-小神经元,且内异症大鼠模型异位子宫内膜病灶和DRG中的ATP释放量以及P2X3受体mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照大鼠的子宫内膜组织和DRG组织,且与模型大鼠的痛敏程度相关。结论:1.内异症大鼠模型病灶P2X3受体表达与ATP水平上调与内异症患者相一致。2.内异症大鼠模型DRG组织P2X3受体表达和ATP含量上调预示其参与内异症疼痛外周敏化过程。第四部分:ADP通过激活ATF3/AP-1通路上调DRG细胞中P2X3受体的表达目的:研究ATP及其他核苷酸类似物在体外对DRG细胞中P2X3受体的调控机制及相应的分子信号转导通路。方法:体外培养DRG细胞系,经ADP干预并检测P2X3受体以及ATF3/AP-1通路分子中ATF3,FOS,JUN的mRNA和蛋白表达水平的变化,并用细胞免疫荧光方法观察上述分子在细胞内的定位;分别应用ATF3过表达质粒和ATF3特异性siRNA转染细胞,观察过表达或敲除ATF3后对P2X3受体表达的影响;合成P2X3受体的启动子序列并将其插入到荧光素酶质粒中,应用荧光素酶报告基因方法检测ADP干预对P2X3受体启动子活性的影响;最后应用染色质免疫共沉淀的方法检测ADP干预后ATF3在P2X3受体启动子上的结合情况。结果:1.P2X3受体表达在DRG细胞膜上,ATP和ADP的干预均增加P2X3受体mRNA和蛋白水平的表达。2.ADP干预激活了 DRG细胞中ATF3/AP-1信号分子通路,上调了 ATF3,FOS,JUN在细胞核内的表达。3.敲除ATF3能有效抑制ADP所致的P2X3受体mRNA和蛋白水平上调。4.ADP干预增加了 P2X3受体的启动子活性。5.ADP干预增加了转录因子ATF3在P2X3受体启动子上的结合。结论:1.ADP干预可以上调P2X3受体在DRG细胞中的表达。2.ADP上调P2X3受体通过激活ATF3/AP-1分子通路,增加转录因子ATF3的表达从而增加P2X3受体的转录活性。第五部分:CSOSA/LPs/SP600125有效抑制ADP介导的P2X3受体的上调及内异症大鼠的疼痛敏化目的:用CSOSA胶束及脂质体LPs包装ATF3/AP-1通路特异性抑制剂SP600125,探究其体外水平对DRG细胞中P2X3受体表达的调控及在体动物模型中对内异症所致的P2X3受体上调和大鼠疼痛敏化的抑制作用。方法:用纳米壳聚糖脂质体CSOSA/LPs包裹ATF3/AP-1通路特异性抑制剂SP600125,观察其粒径大小,表面电位的变化,检测壳聚糖脂质体对SP600125释放的影响;在体外DRG细胞系F11中检测CSOSA/LPs/SP600125的摄取情况以及对ADP介导的ATF3/AP-1分子通路激活和P2X3受体上调的影响;在体水平观察CSOSA/LPs/SP600125在内异症大鼠动物模型中的分布情况,检测药物的干预对内异症大鼠异位内膜病灶和DRG组织中P2X3受体,ATF3的表达和大鼠疼痛敏化的效应。结果:1.CSOSA/LPs能有效包裹抑制剂SP600125,并减缓药物的释放速率。2.CSOSA/LPs/SP600125能有效被DRG细胞系F11所摄取,并同SP600125一样能有效抑制ADP干预所以引起的ATF3/AP-1分子通路的激活和P2X3受体的上调。3.CSOSA/LPs/SP600125能有效富集在内异病灶上,抑制内异症所导致的大鼠病灶和DRG组织中ATF3和P2X3受体的上调以及引起的大鼠疼痛敏化。结论:1.CSOSA/LPs载体能有效包裹脂溶性药物SP600125。2.CSOSA/LPs/SP600125能通过抑制ATF3/AP-1通路从而抑制ADP介导的P2X3受体的上调。3.CSOSA/LPs可以作为一种药物递送系统,将难溶性药物有效富集到异位内膜病灶,达到靶向治疗的效果。4.通过ATF3/AP-1通路靶向P2X3受体可能是一种新型的治疗子宫内膜异位症疼痛的方式。