结核分枝杆菌（M. tuberculosis,简称为Mtb）是人类重要病原菌之一,可以导致结核病,严重威胁着人类的健康。近年来,多耐药（MDR）和泛耐药（XDR）Mtb的出现及其广泛传播以及Mtb/HIV共感染的不断出现,使得结核病又呈死灰复燃之势,从而使得人们治疗结核并最终战胜结核的步伐严重受阻,因此,新的抗结核药物的研发显得尤为重要和迫切。生物素,又称为维生素H或辅酶R,是生物体内一些必需酶的辅助因子。这些必需酶包括丙酮酸羧化酶（PC）和酰基辅酶A羧化酶（ACC）等,主要起到羧化、脱羧和转羧基的作用,广泛参与到脂肪酸合成、糖质新生和氨基酸代谢等途径中。生物素合成途径主要分为两部分：一是前体分子庚二酸单酰-CoA（或者庚二酸单酰-ACP）的合成,这一合成途径还没有被很好地描述,而且在不同的物种之间也有所差别；二是从庚二酸单酰-CoA（或者庚二酸单酰-ACP）到生物素的合成过程,这一过程又可分成四步反应,分别由BioF、BioA、BioD和BioB催化完成。这四步反应在所有存在生物素合成途径的生物中都是非常保守的。研究已证实生物素作为一种辅助因子在结核分枝杆菌细胞壁组分脂肪酸的合成中不可或缺。而且生物素合成途径只存在于植物、真菌和细菌（包括分枝杆菌）中,而哺乳动物细胞中缺少重新合成生物素所需的酶,只能从外界摄取,这使得生物素合成途径成为一个很具有潜力的可以用来研发新的抗结核药物的靶标。目前针对于这一途径的抗生素主要有氨基丁酸酶素和酸酶素,它们的靶标都是该途径中的BioA,但实验已经证明它们体内抑菌效果都很差。作为催化生物素合成保守途径中的第一个酶,BioF（8氨基-7酮基壬酸合成酶）在保守的四步反应中起着“守门人”的关键作用。BioF是一个PLP依赖性的酶,可以将丙氨酸和庚二酸单酰-CoA（或者庚二酸单酰-ACP）脱羧缩合生成8氨基-7酮基壬酸（KAPA）。结核分枝杆菌基因组上有两个BioF的编码基因,它们分别为bioFl（Rv1569）和bioF2（Rv0032）,它们所编码的蛋白分别命名为MtBioF1和MtBioF2,其中MtBioF2除了含有BioF结构域外,还含有一个乙酰基转移酶结构域。而耻垢分枝杆菌（M. smegmatis,简称为Msm）基因组中只含有一个BioF编码基因（bioF, MSMEG₃189）,其所编码的蛋白命名为MsBioF。MsBioF与结核分枝杆菌中的MtBioF1和MtBioF2BioF结构域的同源性分别为76%和35%。结核分枝杆菌中bioF基因的重要性已经得到广泛的认可和证实,作为一个潜在的药物靶点,分枝杆菌中BioF的结构性质和催化反应机制还不清楚,需要进一步研究。本文主要以结核分枝杆菌的模式生物耻垢分枝杆菌中的MsBioF展开研究,主要的创新研究结果如下：1、利用大肠杆菌表达系统表达纯化出较高质量的MsBioF蛋白,并对其进行了理化性质的分析。我们首先构建了MsbioF E. coli表达菌株,纯化出MsBioF,并对其序列进行了Maldi-TOF质谱鉴定。在随后的MsBioF理化性质的研究中,发现与E. coli中的同源蛋白AONS在溶液状态下为二聚体状态不同的是,MsBioF在所有分离过程中都呈单体状态。和AONS可以与PLP结合形成共价加合物不同,用Q-TOF测定分子量的方法证明,溶液状态下的MsBioF不能与PLP形成共价结合物,说明单体状态的MsBioF可能不具有结合PLP的能力。这说明MsBioF与E. coli的AONS在体外聚集形式以及与PLP结合能力的不同,印证了分枝杆菌的生物素合成途径与E. coli是存在差异性的。同时我们将经TEV蛋白酶去除His标签的重组MsBioF免疫小鼠,得到特异性的抗MsBioF血清,并对MsBioF体内表达进行了Western blot鉴定。2、获得了MsBioF的蛋白晶体,解析了MsBioF的结构,并发现了其特有结构特点。在MsBioF纯化方法的基础上,对MsBioF纯化步骤进行了优化,筛出了三个晶体生长的条件,对这三个条件都进行了pH值、盐浓度和沉淀剂浓度的优化,在Index45和Index91两个条件下优化获得了衍射较好的晶体,最终得到的MsBioF结构的分辨率为2.3A。将获得的MsBioF晶体进行X-光衍射数据的收集,对MsBioF的结构进行了解析。研究结果显示,与在体外溶液状态不同,MsBioF的晶体结构显示其在结晶状态下为二聚体。通过与同源蛋白AONS的结构的对比,发现MsBioF与AONS的整体结构是类似的,但又存在明显的差异。与E. coli AONS的结构对比,MsBioF结构中除α6,α7和α13外,其他的α螺旋都向中间收紧；另外,MsBioF的α5和α13明显比E. coli AONS对应的α螺旋要长,而a1和α11比E. coli AONS中的要短；由于α螺旋位置和长度的变化导致连接它们的loop也发生了摆动。3、通过两步交换对耻垢分枝杆菌中的MsbioF进行了无标记地敲除,揭示了MsbioF在生物合成途径中具有关键性作用,证明了MsbioF的作用是通过影响生物素依赖蛋白的生物素化来实现的。借助plNIL和pGOAL两种质粒,采用两步交换的方法成功对耻垢分枝杆菌中的MsbioF进行了无标记敲除。通过测定△MsbioF在有无外源生物素两种情况下的生长情况,发现△MsbioF为生物素营养缺陷型,在无外源生物素的情况下表现为不生长。测定了△MsbioF在不同生物素浓度下的生长情况,结果显示体外生物素浓度低于5nM的时候无法生长,低于25nM时生长繁殖明显减慢,只有高于50nM时才能正常生长,而这一生物素浓度至少为人体内生物素的生理浓度的10倍。该菌对生物素的生长依赖性,显示其生物素合成途径中的各组分酶是很有潜力的药物靶标。当以抗生物素的抗体为一抗时,用western-blotting的方法验证敲除株中生物素依赖蛋白的表达变化,发现△MsbioF在无外源生物素的情况下培养48h后,生物素依赖蛋白AccA3的生物素化水平比对照蛋白RpoA明显降低,说明了MsbioF的作用是通过影响生物素依赖蛋白的生物素化来实现的4、通过序列比对和结构叠合,确定了MsBioF可能的催化活性位点,并对这些位点和截短体进行了体内功能研究。通过MsBioF与AONS序列比对和结构叠合,鉴定出MsBioF活性部位中的起决定性作用的氨基酸残基。将这些可能的残基分别突变成Ala,回补到△MsbioF中,观察回补后菌株的表型变化。研究发现,His129、Asp200和Lys235是MsBioF体内发挥作用所不可缺少的,说明这三个氨基酸在MsBioF催化反应中具有关键的作用；His203突变后对MsBioF并无明显影响；Glul71点突变的回补菌株在无外源生物素存在的情况下生长迟缓,说明Glu171残基在维持MsBioF体内活性起着重要的作用,其突变只是降低了MsBioF活性。为揭示MsBioF在体内行使功能时的聚集状态,我们将在MsBioF二聚体形成和维持起关键作用的编码N端小结构域（1-37位氨基酸序列）的基因序列切除掉,回补到△MsbioF中观察表型变化,结果显示MsBioF的N端小结构域是MsBioF体内发挥活性所必需的,从而揭示了MsBioF在体内行使功能的聚集状态为二聚体。另外通过以上对MsBioF的结构及其活性位点功能的研究,我们阐述了MsBioF可能的活性调节方式,即MsBioF体内活性可能受Cys136-Glu171与His129相互作用的来调节的。5、通过对△MsbioF的回补实验,证明了MtBioF1参与生物素的体内合成,并且发现了MtBioF1与MsBioF无论在结构还是功能上都很保守。结核分枝杆菌基因组注释信息显示,在其基因组中有两个BioF的编码基因,它们分别为bioF1（Rv1569）和bioF2（Rv0032）,它们所编码的蛋白分别命名为MtBioF1和MtBioF2。为探讨这两个同工蛋白在生物素合成中的作用,我们将结核分枝杆菌中的MtBioF1和MtBioF2基因对△MsbioF进行了回补实验。研究结果发现,MtBioF1可以回补MsbioF敲除株的生物素营养缺陷型的表型,而MtBioF2却不能,说明在生物素合成中能够发挥作用的是MtBioF1。至于同工蛋白MtBioF2的作用,还需要进一步的研究。在研究中我们又探讨了MtBioF1在耻垢分枝杆菌中的表达纯化条件,将纯化的蛋白进行分子筛和分析超离分析,发现MtBioF1在体外溶液状态下像MsBioF-样呈单体状态。将MtBioF与MsBioF进行序列比对发现不但二者同源性较高,而且在催化活性中心的His134、Asp205和Lys239等位点以及活性调节位点Cys140和Asp176（对应于MsBioF中的Glu171）处也是保守的。将His134、Lys23和Asp176进行了点突变分析,结果显示这些点突变体与MsBioF中的结果是一致的,说明MsBioF与MtBioF1在结构和功能上都是保守的。