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目的:在HBV慢性复制小鼠模型中,研究HBV E抗原(HBe Ag)如何参与调节机体的免疫应答及其机制。方法:1.HBV野生型质粒H1.2(p AAV-HBV1.2)、HBV突变型质粒E(-)(p AAV-HBV1.2-HBe Ag(-),不表达HBe Ag的HI小鼠,构建CHB小鼠模型。E(-)和HBe Ag表达载体p CDNA-HBe Ag质粒(E(-)+E)同时HI,研究HBe Ag的调控作用。2.ELISA检测血清中HBV相关的抗原抗体表达:HBsAg、HBe Ag、anti-HBs、anti-HBe、anti-HBc等;ELISA对anti-HBc和anti-HBs抗体进行Ig G1,Ig G2a分型;Realtime PCR检测血清中HBV DNA水平。3.Realtime RT-PCR检测肝组织和非实质肝细胞NPC(non-parenchyma cell)中细胞因子的RNA水平;免疫组化法(IHC)检测肝组织中HBc Ag的表达;HE染色看炎症水平。4.酶联免疫斑点检测T细胞功能;流式检测细胞类型及功能。用Graph Pad Prime 5作图,并进行统计分析。结果:1.在HBV慢性复制小鼠模型中,表达HBe Ag的野生型HBV在体内持续复制较长时间,而不表达HBe Ag的HBV突变株在体内被较快清除。2.补充注射E抗原表达载体的E(-)+E组,小鼠血清中HBsAg和HBV DNA持续时间明显较E(-)组延长,提示HBe Ag可能在HBV慢性复制小鼠模型中扮演免疫耐受的角色。3.H1.2组产生HBcAb的比例较高,时间较早;E(-)组产生HBcAb的比例较低,时间较晚。H1.2和E(-)组产生的HBcAb都是Ig G2a型。只有E(-)组部分小鼠在HBV被清除后产生HBs Ab。E(-)组产生的HBs Ab是Ig G1和Ig G2a混合型,提示E(-)组HBV病毒的清除与增强的Th1-Th2型免疫应答相关。4.实时定量RT-PCR结果显示:E(-)组小鼠非实质肝细胞(NPC)中PD-L1、Foxp3的表达水平较H1.2组降低,E(-)+E组NPC中PD-L1、Foxp3的表达水平较H1.2组升高。提示HBe Ag可通过上调负向调控因子PD-L1,活化调节性T细胞等途径发挥抑制免疫应答的作用。5.FACS分析H1.2组和E(-)组小鼠脾脏、肝脏中淋巴细胞类型,结果显示:在高压尾静脉注射后第21天,E(-)组脾细胞中CD8+T细胞比例高于H1.2组;高压尾静脉注射后第28天,E(-)组肝脏中CD8+T细胞比例高于H1.2组。进一步提示HBe Ag负调控肝内CD8+T细胞的募集,发挥免疫耐受作用。结论:1.HBe Ag在HBV慢性复制小鼠模型中发挥着免疫耐受作用。HBe Ag可能通过上调NPC中Kupffer细胞或DC细胞PD-L1的表达,活化PD-L1-PD1负调控通路而发挥免疫耐受作用;或者HBe Ag通过活化Treg细胞,抑制T细胞应答而发挥免疫耐受作用。2.由于缺乏HBe Ag的免疫耐受作用,不表达HBe Ag的HBV突变株在小鼠体内可刺激机体产生较强的Th1-Th2型免疫应答,招募更多的CD8+T细胞到肝脏,导致HBV突变株被急性清除及更重的肝脏炎症反应。