研究背景急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)主要由动脉粥样硬化引发的冠状动脉狭窄引起,导致心肌缺血、损伤、心源性休克或心脏骤停,是临床上猝死的主要原因。在美国,每年大约有62万新增AMI病例,其中15%的人死于该疾病。与普通人群相比,AMI幸存者患病及死于心脏或其他原因的概率更高。此外,有AMI病史的患者发生感染的风险增加了79%。因此,AMI的预防和诊治也是需要立即解决的问题之一。他汀类药物作为HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A)还原酶的竞争性抑制剂,后者是胆固醇生物合成途径的限速酶,因此他汀类药物可以通过降低内源性胆固醇合成从而使低密度脂蛋白中的胆固醇水平降低。他汀类药物广泛应用于高胆固醇血症和冠心病患者。实验证据表明,它们在动脉粥样硬化性心血管疾病的一级和二级预防、以及降低死亡率和非致命性心血管事件发生率方面效果十分显著,并可以改善AMI的临床结局。在他汀类药物中,氟伐他汀是临床上应用最广泛的脂质修饰药物,其副作用和不良反应较小,在动脉粥样硬化的治疗中起着重要作用。氟伐他汀的结构为特殊的开环,因此具有选择性高、结构简单、不易引起不良反应等特征性优点。氟伐他汀在不发生代谢转化的情况下具有较好的药理活性,除具有降脂作用外,还具有稳定斑块、抑制炎症和调节凝血的作用。以往人们认为细胞坏死是心肌梗死过程中细胞死亡的唯一原因。目前研究表明,细胞凋亡也在心肌梗死后组织损伤过程中发挥着不可替代的作用。特别是在心肌梗死后心脏重塑期间,梗死区和边界区的心肌细胞凋亡直接影响心脏功能,并与较高的死亡率相关。因此抑制心肌细胞死亡对于减轻缺血后心脏损伤有很重要的意义。近年来,研究发现缺氧、持续性缺血和再灌注是引起细胞凋亡的主要因素。通过动物实验发现,心肌梗死后大鼠心肌细胞凋亡发生在AMI后不同时间点,心肌细胞凋亡受多种死亡信号介导,并受不同基因调控。然而不同基因对心肌细胞凋亡的作用机制尚不完全确定。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类广泛存在于人体固有免疫系统中,参与非特异性免疫的重要受体蛋白。Tolls通过识别PAMPs和DAMPS的受体等病原体相关分子模式,被激活并引发信号传导,促使机体通过释放炎症介质启动获得性免疫。由此可见,Tolls是人体固有免疫和获得性免疫的桥梁。其中TLR4在心肌细胞、血管内皮细胞以及单核细胞、淋巴细胞中均有表达,可参与心肌缺血再灌注损伤的炎症反应,促进活性氧自由基的形成,并激活多种细胞因子。AMI后TLR4信号通路被激活,大量炎症细胞因子表达并释放可诱导心肌细胞凋亡。我们通过动物实验研究证实氟伐他汀强化治疗能够通过下调TLR4表达,抑制炎症反应、心肌细胞凋亡、改善心脏功能,这个调节通路的证实将具有重要的临床意义。临床上可将TLR4通路的激活作为重要的作用靶点,通过下调单核细胞TLR4的表达,抑制AMI后的炎症反应,从而为心梗患者心脏重构等并发症的防治提供治疗及改善预后的新思路。研究目的1、研究心肌梗死后大鼠炎症因子TNF-α、IL-1β的表达及氟伐他汀的作用;2、观察氟伐他汀对AMI大鼠建模后第14天心肌结构、功能的影响;3、研究氟伐他汀对心梗后心肌细胞凋亡的影响;4、研究氟伐他汀通过TLR4通路对心肌细胞凋亡的影响。研究方法本实验共挑选131只大鼠(6～8周龄),将其随机分为四组:前降支冠状动脉结扎构建急性心肌梗塞大鼠模型(AMI组);结扎后给予氟伐他汀灌胃为治疗组(剂量为30 mg/(kg·d));未进行结扎即缝合的大鼠为假手术组;以及未结扎的大鼠作为正常对照组。AMI组、假手术组及正常对照组均给予同剂量生理盐水灌胃。在本实验中,大鼠AMI建模第5天采用内眦取血,检测并比较各组大鼠血浆中TNF-α、IL-1β的浓度,确定氟伐他汀治疗对炎性因子分泌的影响,来推断其对AMI诱导的大鼠急性炎症反应的抑制作用。通过超声心动图监测各组大鼠第14天心功能及结构的变化,并检测心功能标志物BNP变化。选择建模第7天大鼠,制作心肌组织标本,利用DNA原位末端缺口标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况;免疫荧光技术检测凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、Bax、HSP70蛋白表达。定量RT-PCR检测了四组大鼠心肌细胞中TLR4 mRNA的表达水平,并采用免疫印迹法检测TLR4蛋白的表达量,以证明TLR4信号通路与AMI及氟伐他汀治疗的潜在关系。研究结果大鼠结扎后,可见局部心室前壁变白、紫绀、左心房肿胀;心电图示ST段明显抬高;超声心动图显示EF、FS明显下降,提示建模成功。大鼠AMI模型建立后5天血浆IL-1β和TNF-α的浓度明显升高,与正常对照组及假手术组比较有显著性差异,P<0.001;给予氟伐他汀干预后有所下降,与AMI模型组比较具有显著性差异(P<0.05)。这些结果表明氟伐他汀治疗可以一定程度上抑制AMI导致的急性炎症反应。大鼠AMI建模后第14天,氟伐他汀治疗组心功能较MI组提高,同时监测血浆心功能标志物心房钠尿肽BNP升高,而氟伐他汀治疗组显著降低(P<0.05)。原位细胞凋亡检测发现正常对照组心肌细胞偶见TUNEL 阳性细胞;假手术组亦散在极少TUNEL 阳性细胞,与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。MI组可见大量TUNEL阳性细胞,凋亡细胞占全部细胞的30.41±3.12%;与正常对照组及假手术组比较均有显著性差异,P<0.01。与MI组比较,氟伐他汀治疗组TUNEL阳性细胞减少,凋亡细胞占全部细胞的19.28±3.86%,亦具有显著性差异,P<0.05。激光共聚焦显微镜下观察,正常对照组未检测到Caspase-3蛋白表达,假手术组偶见Caspase-3免疫阳性细胞,两组细胞均偶见Bax、HSP70蛋白散在微弱表达,而Bcl-2蛋白表达强度较强,且两组之间无显著性差异(P>0.05)。AMI建模后,可见大量Caspase-3、Bax免疫阳性细胞分布,Bcl-2、HSP70表达减弱,与正常对照组及假手术组比较均有显著性差异。经氟伐他汀干预Bcl-2、HSP70表达较MI组增高,其他两种蛋白的表达量与MI组比较有所降低,且具有显著性差异。这些数据表明氟伐他汀在大鼠AMI干预过程中能明显抑制心肌细胞凋亡。四组大鼠心肌细胞中均有TLR4 mRNA表达。正常对照组中TLR4的表达为0.902±0.140,假手术组TLR4的表达为1.214±0.274。而MI组大鼠心肌细胞中的TLR4表达量较前两组明显升高,达到3.412±0.879,且差异有统计学意义(P<0.05)。值得注意的是,与MI组相比,经过氟伐他汀治疗后大鼠心肌细胞TLR4 mRNA 的表达量显著降低至 1.864±0.467(P<0.05)。类似地,正常对照组与假手术组比较,TLR4蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。MI组与正常对照组、假手术组相比,TLR4蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。氟伐他汀治疗组与MI组比较TLR4蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。研究结论1、心肌梗死后,炎症因子TNF-α、IL-1β表达增加,同时心功能受损,心室发生重构,氟伐他汀通过抑制其急性炎症反应减轻心肌损伤及心室重构,改善心脏功能;2、氟伐他汀通过下调TLR4表达减少心肌细胞的凋亡,抑制AMI的发生和发展。通过研究将有助于从分子和细胞水平上了解氟伐他汀治疗AMI的疗效机制。