胃肠道屏障受损会导致肠道微生物及其代谢产物易位，引发炎症，与肿瘤驱动基因突变共同促进胃肠道癌症的发生发展。Akkermansia muciniphila（A.muciniphila）作为新兴的潜在益生菌，不仅在抗如糖尿病，肥胖症以及衰老中起到重要作用，而且在炎症性肠病（IBD）及相关性肠道癌症等的改善方面的也发挥关键作用。Amuc-1100，是一种32kDa的蛋白质，为A.muciniphila外膜最丰富的菌毛样蛋白质之一。有研究表明Amuc-1100单独作用就可以发挥A.muciniphila很大部分的益生功能，Amuc-1100蛋白处理的糖尿病、肥胖以及肠炎相关癌症的小鼠可以增强肠道屏障功能，改善相关疾病的预后，说明其益生作用很可能一部分是通过调节肠道屏障功能而实现的作用。然而限于现有Amuc-1100的研究较少，其对肠道屏障作用的保护机制尚无定论。为此，本实验以Caco-2肠上皮细胞模型作为模拟的体外肠道屏障，通过将Amuc-1100作用于Caco-2细胞单层，来探索其调节肠道屏障的可能机制。
　　目的：
　　在文献调研后的理论基础上，利用Caco-2细胞建立体外肠上皮屏障模型，进一步研究Amuc-1100蛋白对肠道屏障保护作用的可能作用机制。
　　方法：
　　建立Caco-2细胞肠上皮单层屏障模型，模拟体内肠道屏障，通过观察倒置显微镜下单层上皮细胞形态、测量其跨膜电阻值（TEER）来评估其完整性、细胞极性（碱性磷酸酶，AKP）等方面来评估Caco-2肠上皮单层屏障模型有效性。通过构建重组表达载体pET28a-Amuc1100，诱导表达，最后纯化得到Amuc-1100蛋白。使用不同浓度的Amuc-1100刺激Caco-2细胞单层屏障，测定Caco-2肠上皮单层屏障模型中跨上皮电阻（Trans-Endothelial Electrical Resistance,TEER）值的变化和测定碱性磷酸酶（ALP）数值，评估Amuc-1100对肠上皮屏障完整性的影响。通过Elisa kit检测IL-8的分泌，研究Amuc-1100对Caco-2细胞的促炎能力；通过荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，RT-PCR)和Western blot(WB)等方法来检测紧密连接（Tight junction,TJ）相关蛋白Occludin、ZO-1、claudin-1,claudin-3表达变化，从紧密连接相关蛋白表达水平的变化情况判断Amuc-1100蛋白对肠道屏障影响的可能机制。实验结果数据用平均差±标准差（mean±SD）来表示，P＜0.05具有统计学差异。应用GraphPad Prism version5.0统计软件进行统计学分析。
　　结果：
　　（1）Caco-2在第4天开始融合，第5天到第7天TEER值变化不大，从第7天起，TEER值开始增长，增长至第15天时接近稳定，一直持续到21天培养结束。碱性磷酸酶(ALP)测定Caco-2细胞单层呈明显极性，Caco-2肠上皮细胞体外模型建立成功，具有很好的可靠性和可重复性。
　　（2）5组（0.01μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml）不同浓度Amuc-1100蛋白处理Caco-2细胞单层屏障的均可观察的TEER数值的升高，但并没有呈现梯度相关性，其中0.5μg/ml对肠道屏障的影响最大（P＜0.01）。
　　（3）Q-PCR结果表明，Amuc-1100蛋白组处理Caco-2细胞单层屏障后，相比NC组，能提高Occludin、ZO-1、claudin-1,claudin-3的mRNA的表达。在6组实验分组中（NC组、0.01μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml），0.5μg/ml组提升紧密连接蛋白（TJ）的mRNA水平效果最好。
　　（4）Western blot结果表明，0.5ug/ml的Amuc-1100蛋白处理Caco-2细胞单层屏障后，相比对照NC组，能提高Occludin、ZO-1、claudin-1,claudin-3的蛋白表达量。
　　结论：
　　（1）Caco-2肠上皮细胞体外模型建立成功，具有很好的可靠性和可重复性。
　　（2）本实验通过Caco-2细胞形态学观察、跨膜电阻值（TEER）的测定以及碱性磷酸酶(ALP)活力值的测定结果联合评价Caco-2肠上皮单层屏障模型，结果提示该屏障模型具有很好的完整性和极性，可以模拟体内肠道屏障。
　　（3）Amuc-1100蛋白处理组相比对照组而言，其能提高Caco-2细胞单层的TEER值，增强肠道屏障细胞间的紧密连接。
　　（4）Amuc-1100蛋白能提高相关紧密连接蛋白的mRNA和蛋白相对表达量，从而增强肠上皮屏障功能。Amuc-1100蛋白存在最佳浓度作用范围。