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目的：1.研究无血清培养法和免疫磁珠分选法用于人骨肉瘤类肿瘤干细胞的分离培养,探讨两者作为分选方法的可行性。2.研究Nanog在人骨肉瘤及其类肿瘤干细胞的中的表达及意义。3.研究LY294002对人骨肉瘤类肿瘤干细胞增殖和细胞周期的影响,并初步探讨其抑制增殖作用可能的机制。4.研究LY294002对人骨肉瘤类肿瘤干细胞凋亡的影响,并初步探讨其诱导凋亡作用可能的机制。方法：1.无血清培养法分离人骨肉瘤类肿瘤干细胞；免疫磁珠分选CD133+CD44+人骨肉瘤细胞；免疫组织化学法鉴定人骨肉瘤类肿瘤干细胞CD44和CD133的表达情况；蛋白印迹法检测骨肉瘤及其类肿瘤干细胞Nanog的表达并进行半定量分析。2.实验分组：LY294002在培养基中的浓度分别为0μmol/L(对照组)、5μmol/L、15μmol/L和45μmol/L。3.CCK-8法检测人骨肉瘤类肿瘤干细胞在不同LY294002浓度下的增殖情况；碘化丙啶PI染色流式细胞术检测人骨肉瘤类肿瘤干细胞在不同LY294002浓度下细胞周期的变化；蛋白印迹法法检测人骨肉瘤类肿瘤干细胞在不同LY294002浓度下总AKT、磷酸化AKT和β-肌动蛋白的表达情况。4. Annexin V/PI双染法流式细胞术检测人骨肉瘤类肿瘤干细胞在不同LY294002浓度下的凋亡情况；蛋白印迹法检测半胱天冬酶-3、活化型半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-9、活化型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和β-肌动蛋白的表达情况。结果：1.采用无血清培养法可以从人骨肉瘤MG63细胞中分离出成“细胞球”生长的人骨肉瘤类肿瘤干细胞；采用免疫磁珠法可以从人骨肉瘤MG63细胞中分离出CD133+CD44+人骨肉瘤细胞,该细胞亦可在含表皮生长因子和成纤维生长因子的无血清培养基中形成“细胞球”；将上述骨肉瘤类肿瘤干细胞球传代于无血清培养基仍可形成相似的人骨肉瘤类肿瘤干细胞球；人骨肉瘤类肿瘤干细胞CD44和CD133均呈阳性表达；人骨肉瘤类肿瘤干细胞Nanog表达水平强于人骨肉瘤MG63细胞(P<0.05)。2.与对照组相比较,无论何种浓度的LY294002均对人骨肉瘤类肿瘤干细胞的增殖有一定的抑制作用,且其抑制作用与剂量有一定的相关性；各干预组与对照组比较人骨肉瘤类肿瘤干细胞中Go/G1期的细胞比例明显增多(P<0.01),增殖指数明显减低(P<0.01)；随着LY294002浓度的不断增加,人骨肉瘤类肿瘤干细胞中的pAKT表达量逐渐下降。3.随着LY294002浓度的逐渐增加,各干预组活细胞有所下降,而凋亡有所增加,这种对凋亡的促进作用同样表达出一定的剂量依赖性,其中45μmol/L组最为明显(P<0.01)；在对照组和干预组中均可以检测到半胱天冬酶-3的表达,但是活化型半胱天冬酶-3只有在干预组中才能观察到明显的表达,且活化型半胱天冬酶-3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的表达量随LY294002浓度的增高也呈现上升趋势。结论：1.无血清培养法可以用于人骨肉瘤类肿瘤干细胞的分离和培养；Nanog作为维持细胞多能性的关键蛋白,可能成为分离和鉴定入骨肉瘤类肿瘤干细胞的标志之一。2.LY294002对人骨肉瘤类肿瘤干细胞表现出对增殖的抑制作用,该作用可能是通过其抑制PI3K而导致其下游AKT活性减弱,细胞发生G0/G1期细胞周期阻滞所介导的。3.LY294002对人骨肉瘤类肿瘤干细胞表现出对凋亡的促进作用,该作用可能是通过其抑制PI3K导致其下游AKT活性减弱,从而激活半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶等参与的凋亡通路所介导的。