研究背景：卵巢癌是美国女性中第五大癌症死亡病因。大约25%被诊断为局限于一侧或双侧卵巢疾病的女性,其5年存活率较高(75%-90%)；然而,对于75%被诊断为Ⅲ和Ⅳ期卵巢癌的女性,其长期无病生存的可能性很低(15%-20%)。卵巢癌分两种截然不同的Ⅰ型和Ⅱ型,卵巢癌最初被认为是起源于卵巢表面上皮。Ⅰ型卵巢癌(透明细胞癌、粘液性癌和低级的浆液性和子宫内膜癌)在诊断时通常局限于卵巢,由交界肿瘤前体发展而来,且其典型的体细胞突变基因相对稳定,包括KRAS, BRAF, PIK3CA, ErbB2除了TP53。Ⅱ型卵巢癌(高级浆液、高级子宫内膜样、恶性中胚叶混合肿瘤以及未分化癌)恶性程度越高,更具侵袭性,认为是由输卵管上皮癌发展而来,且基因不稳定以体细胞TP53突变为特征,但Ⅰ型肿瘤很少出现突变特征。先前数据也表明,卵巢癌发病机理可能依赖于卵巢表面上皮内的炎症反应。“不断排卵”的病因假说(增加一生排卵的时间与卵巢癌风险增加有关)支持了这一假设。排卵可导致卵巢表面上皮重复创伤,需要通过招募白细胞、细胞因子、趋化因子、释放一氧化二氮、DNA修复、组织重组等介导的炎症反应修复。重组可导致上皮细胞被困在包涵囊肿内部,局部微环境似乎可诱导获得类肿瘤生成的特征如p53积聚和较表面上皮细胞增加九倍的增殖指数。上皮间质转化(EMT)是最初见于胚胎发生的过程,可引起间叶细胞的产生。上皮细胞经过上皮间质转化后可迁移到细胞外环境以及定居在新器官。近年来,上皮间质转化样过程被认为是决定肿瘤细胞侵袭和迁移的重要步骤。目前肿瘤进展的研究表明,在上皮间质转化的过程中,肿瘤细胞丧失本身上皮样特点而获得某种间叶细胞的特性,从而促进对细胞外基质的侵袭以及远处转移。被EMT相关转录因子负性调节的细胞靶点之一就是E-钙粘蛋白,是经典钙粘蛋白家族的原型成员。核因子kappaB(NF-xB)指的是一类转录因子家族(也被称为Rel家族),调节超过400个基因的表达。这些调节的基因在许多细胞过程中是至关重要,其中包括多种细胞因子、趋化因子、促炎基因、粘附分子、急性期反应蛋白、补充因子、应激反应基因、氧化酶、细胞凋亡基因、生长因子和其他转录因子等。由于这一调节作用,NF-κB被认为与几种疾病有关,包括心血管疾病和各种癌症。证据表明NF-κ在许多肿瘤细胞系中组成型激活,从而影响肿瘤的进展和对化疗的反应NF-κB介导的信号通路可通过抑制凋亡、血管的生成、增殖和炎症等肿瘤的特征来促进生存。卵巢肿瘤可以获得增强NF-κB功能,来回避凋亡通路和抵抗外界环境的伤害,如抗肿瘤免疫效应物或化疗。在体外或人类细胞系异种移植中NF-κB活性的抑制可增加细胞对顺铂和紫杉醇诱导凋亡的敏感性,而铂类联合紫杉醇是最常用的卵巢癌的一线治疗。肿瘤坏死因子-α(TNFa)可引起细胞的凋亡,然而,卵巢癌之所以产生细胞耐受,主要是癌细胞可以上调信号通路引起NF-κB激活和引发凋亡抑制蛋白的产生。除了在肿瘤细胞中的直接作用外,NF-κB介导的事件也可导致与卵巢癌相关微环境和腹膜炎症的发生。NF-κB在炎症中的核心作用已引起了广泛的关注,因为抗肿瘤免疫反应能改善患者的预后。卵巢肿瘤被各种免疫效应器浸润,包括抗肿瘤T细胞。免疫浸润的类型可影响疾病的进展.趋化因子及细胞因子控制抗肿瘤免疫反应类型,这些细胞因子由浸润肿瘤的巨噬细胞、树突状细胞和肿瘤本身产生。所有这些NF-κB的功能似乎均在卵巢癌中发挥作用,因此进一步了解NF-κB介导的生物学活动能更好地识别女性患卵巢癌的风险,从而促进发现更有效的治疗策略。大量证据支持NF-κB在卵巢癌细胞和抗肿瘤免疫反应中的重要性,因此我们可假设此炎症相关癌症的原因不明的风险是由于NF-κB通路中的基因变异导致的。文献报道,NF-KB/Snail通过调控EMT,参与乳腺癌细胞迁移、侵袭过程白蔹素(3,5,7,3’、4’、5’-六羟基2,3二氢黄酮醇,AMPLS)是一种最常见的从显齿蛇葡萄类植物(称为藤茶)的嫩茎和嫩叶中分离出的类黄醇。AMPLS不溶于水(0.67 mM 25℃)和含水或有机的溶剂,AMPLS暴露在光线下容易分解,形成一个彩色的光解产品。低水溶性、低肠道通透性低和易于在溶液中降解等特点限制了AMPLS在大多数药物制剂和作为实验化合物的潜能。白蔹素具有许多药理活性,如抗炎抗菌活性、减轻咳嗽以及抗氧化、降压、保肝和抗癌的效果。最近的一项研究报道了AMPLS抗人类免疫缺陷病毒(HIV)及其与HIV-1受体趋化因子受体CXCR4的作用。AMPLS的抗病毒作用可能与其抗氧化属性相关。AMPLS抑制体外黑色素瘤细胞的生长和侵袭并抑制体内黑色素瘤的转移。AMPLS通过体内抑制癌细胞增殖来抑制肺癌的生长。AMPLS通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)和基本纤维母细胞生长因子(bFGF)的分泌产生抗血管生成活性。AMPLS通过减少p糖蛋白的表达也可逆转体外白血病细胞多药耐药性。AMPLS在多种肿瘤细胞中被证实具有抗癌活性。推测白蔹素对卵巢癌有一定作用并寻找可能机制,为卵巢癌治疗提供新思路。因此,本研究的主要目的在于研究白蔹素对卵巢癌发生的影响及其可能的信号通路机制。研究目的1.探讨白蔹素对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响；2.探讨白蔹素对上皮细胞-间充质细胞转换的影响；3.探讨白蔹素对卵巢癌的影响及其相关信号通路。研究方法：1.细胞培养A2780细胞系,即人卵巢癌细胞系,购买于美国种质保藏中心,由包括10%胎牛血清的RPMI1640于37摄氏度、5%C02孵箱里培育。2.MTT实验将A2780细胞以5000个／孔的密度接种于96孔板,用白蔹素以不同浓度和不同时间点刺激细胞后,MTT(5 mg/ml,20μl)加孔中并孵育4h,再放入80μlDMSO孵育15分钟。取490nm波长,微型板块光度计测量每个孔光吸收数值。3.刮伤愈合实验A2780细胞以1×106/孔密度培养于6孔板,用吸管以相同宽度的直线划过A2780单层细胞,与25μm白蔹素孵化后24 h,显微镜下拍照、测量、分析。4. Transwell实验将A2780细胞接种于24孔板内,上室为含1%胎牛血清RPMI1640,下室为含10%胎牛血清RPMI1640。细胞(1x105／孔)放上室于37℃、5%C02的孵箱中培育,24小时后,下层的细胞甲醇固定30分钟再用结晶紫染色,上层拭去。5. Western Blot检测刺激后,采集A2780cell并裂解,试剂盒测蛋白浓度,用特异性抗体测定E-cadherin, N-cadherin的表达,以及波形蛋白,GAPDH, NF-κB, p-IkBa, Snail.并用Photoshop软件进行条带灰度分析。6.统计学分析应用预测分析软件(PASW)统计18.0。正态分布数据用单因素方差分析,非参数变量用Mann-Whitney U检验分析。P<0.05认为具有统计学意义。研究结果1.白蔹素抑制卵巢癌细胞的增殖以0,5,10,25,50μM浓度的白蔹素刺激A2780细胞,在以50μM的白蔹素孵育24h后,细胞增殖显著受抑制；以低于50μM的白蔹素孵育,抑制效果并不明显。而后分别以25μM和50μM的白蔹素在不同时间点(Oh, 1h,3h,6h,12h,24h and 48h)刺激A2780细胞,50μM的白蔹素刺激24h后可显著抑制细胞增殖,而25μM的白蔹素在刺激48h后并不能抑制细胞增殖。2.白蔹素抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭伤口愈合实验中,白蔹素刺激后划痕距离较未加刺激宽,表明白蔹素可抑制A2780细胞的迁移。Transwell实验中,白蔹素刺激后由上室侵袭到下室的细胞明显减少,表明白蔹素可抑制A2780细胞的侵袭。3.白蔹素浓度依赖方式改变卵巢癌细胞中上皮-间充质转换(EMT)标记物表达以不同浓度(5,10,25 and 50μM)刺激卵巢癌细胞,而后继续孵育12h。结果表明,白蔹素可显著增加上皮标志物E-钙黏蛋白的表达以及降低间充质标志物N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达。这一结果表明,白蔹素可以浓度依赖的方式改变EMT标志物的表达,从而提示我们白蔹素对A2780细胞迁移和侵袭的影响或许与EMT有关。4.白蔹素抗转移机制与NF-κB通路有关以不同浓度(5,10,25 and 50μM)白蔹素刺激12h,分别提取细胞浆和细胞核中的蛋白,检测P65和IκBα的表达。细胞浆中p65的表达显著增加而细胞核中表达下降。同时,细胞浆中iκBα的磷酸化在白蔹素刺激后下降。在加入白蔹素前,用NF-κB通路抑制剂BAY11-7082(20μM)预处理2小时。结果显示,BAY 11-7082显著逆转白蔹素诱导的E-钙黏蛋白的增加及N-钙黏蛋白和波形蛋白的下降。5.白蔹素通过NF-κB激活诱导Snail上调以浓度梯度(5,10,25 and 50μM)的白蔹素刺激卵巢癌细胞24h。结果显示,白蔹素随浓度增加能明显抑制Snail的表达,在浓度为50μM的达到最大活性。BAY11-7082(20nM)预处理2h可显著消除白蔹素的抑制性影响。以上结果表明,NF-κB是Snail的关键调节者,白蔹素至少部分是通过抑制NF-κB通路抑制Snail的表达。结论1.白蔹素可抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭；2.白蔹素的抑制作用呈浓度和时间依赖性；3.白蔹素可以浓度依赖的方式改变EMT标志物的表达；4.白蔹素通过NF-κB信号通路诱导Snail的表达。