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背景股骨头缺血性坏死(Avascular Necrosis of the Femoral Head, ANFH)是骨科常见疾病之一,可发生于所有年龄组,但在中青年中较为多见。其病因多由于环境危险因素和/或遗传易感因素共同作用而引起。人类血管内皮细胞一氧化氮合成酶(Endothelial nitric oxide synthase, eNOS)合成的一氧化氮(Nitric oxide, NO)作为具有多种功能的生物分子,参与了许多生理过程如血管再生、血栓形成、凝血和纤溶等功能。研究表明：由于eNOS的基因多态性影响血管内皮产生NO的功能,而与一些血管疾病如冠心病、心肌梗塞、高血压、中风和肾脏疾病等相关。其中关于eNOS基因中的内含子4(Intron4)的等位基因变异和外显子7(Exon7)的位点变异与多种疾病的关系已见报道,但罕见关于eNOS基因变异与ANFH关系的报告。目的观察eNOS基因多态性和ANFH发病风险的关系,以及eNOS基因内含子4和外显子7不同的等位基因与已知的ANFH发病危险因素酗酒和使用激素的可能关系。进一步探索ANFH的遗传易感因素和相关发病机制,为ANFH易感人群的筛查、早期诊断和早期干预提供科学依据,有利于防止ANFH的发病和提高其诊断率及治疗成功率。方法选择中南大学湘雅二医院骨科病房住院和门诊就医的2012年1月至2013年4月ANFH病人75例。排除明显的髋关节外伤史,按Ficat诊断与分期标准进行ANFH的临床诊断和分期,并按常见的临床病因分为特发性股骨头坏死、激素性股骨头坏死和酒精性股骨头坏死。另选健康体检门诊人群75例作为对照组,其年龄、性别、外伤史和血管病变史情况与病人组相匹配,两组人群均遵循了知情同意的原则。每例ANFH病人或健康对照者均从静脉采取5mlEDTA抗凝全血,24小时内Ficoll分离法分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。PBMC经细胞裂解液裂解后以常规异丙醇-乙醇法提取总DNA,并经0.8%琼脂糖凝胶电泳显示单个条带证实。以eNOS的内含子4特异性引物和外显子7特异性引物对每例标本进行多聚酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)特异性扩增。Intron4的PCR产物再经2%琼脂糖凝胶电泳显示出约420bp或393bp的Intron4目标条带,纯化后上机检测DNA序列图谱分析决定属于b/b等位基因,a/b等位基因或a/a等位基因。另外exon7的PCR产物经纯化后以限制性内切酶分析其DNA片段长度多态性(Retriction fragment length polymorphism, RLFP),以2%琼脂糖凝胶电泳后显示的248bp的1条、163bp+85bp的2条或163bp+85bp+248bp的3条带决定其属于G894T(即Glu298ASP)的野生型、纯和突变型或杂合型。实验结果采用spss18.0软件进行统计学分析。结果共分析ANFH病人75例,其中男27例,女48例,年龄平均56.4±13.9岁；健康对照者75例,其中男30例,女45例,年龄平均58.9±11.6岁,两组均无髋关节外伤史和血管病变史,男女比例和年龄无明显区别(p>0.05)。ANFH人群根据临床病因可分为特发性、激素性和酒精性各41例、13例和21例。二组人群PBMC的DNA特异性扩增后,经基因检测分析显示eNOS内含子4等位基因的b/b型(野生型即无突变型)、b/a(杂合型即一条链变异)、a/a型(纯合突变型,即二条链均变异)的出现频率分别为：64例(85.3%)、10例(13.3%)、1例(1.3%)；正常对照组ANFH组71例(95.7%)、4例(5.3%)、0例(0)。ANFH组的b/a型出现频率(10/75,13.3%)明显高于正常对照组的b/a型出现频率(4/75,5.3%),二者比较有显著差异(p=0.0172,OR=3.903)。经PCR-RLFP分析二组的eNOS外显子7-G894T(对应于氨基酸序列的298位Glu->Asp变异)等位基因的G/G野生型(二个核苷酸位点均为鸟嘌呤)、G/T杂合型(一个位点变为胸腺嘧啶)、T/T纯合突变型(两个位点均变为胸腺嘧啶)的出现频率分别为：ANFH组51例(68%)、20例(26.7%)、4例(5.3%),正常对照组61例(81.3%)、12例(16%)、2例(2.7%)；ANFH组的G/T型出现频率(20/75,26.7%)明显高于正常对照组的G/T型出现频率(12/75,16.0%),二者比较有显著差异(p=0.0345,OR=2.876)。另外ANFH组的外显子7的T/T型出现频率(4/75,5.3%)也高于正常对照组的T/T型出现频率(2/75,2.7%)(p>0.05)。在ANFH组病人的内含子4序列中,特发性、激素性和酒精性病因的出现频率b/a型出现频率分别为7/41(17.1%)、1/13(7.7%)、2/21(9.5%),其中特发性ANFH病人b/a型出现频率明显高于正常对照组的b/a型出现频率(7/41(17.1%)vs.4/75(5.3%))；外显子7的G894T基因序列(Glu298Asp氨基酸)变异中,特发性、激素性和酒精性病因的T/T突变出现频率分别为3例(7.3%)、η例(0)、1例(4.8%),虽然因样本量太小,无显著统计学差异,但特发性ANFH组明显高于正常对照组3/41(7.3%)vs.2(2.7%))。结论1.首次发现中国人的eNOS基因和股骨头缺血性坏死的产生可能有一定关系,其基因多态性是影响股骨头坏死的病因之一。2.发现eNOS基因的内含子4序列中b/a基因型使股骨头缺血性坏死的发生率增加,外显子7序列中894G/T基因型也是股骨头缺血坏死的危险因素之一。3.在产生股骨头缺血性坏死的特发性、激素性、酒精性病因中,内皮细胞一氧化氮合成酶内含子4的b/a基因型和外显子7的894G/T基因型对特发性股骨头坏死的影响更明显。图8幅,表7个,参考文献76篇。