论文部分内容阅读
昆虫滞育的内分泌调控机制一直是昆虫学研究领域的重要问题,也是害虫防治和昆虫成功繁殖的理论基础。大量研究显示,低水平的保幼激素（juvenile hormone,JH）是诱导昆虫进入生殖滞育的内分泌基础。然而,在一些具有生殖滞育特性的昆虫中发现生殖和滞育个体中蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）滴度有明显差异,暗示20E对生殖滞育的发生具有潜在调节作用。研究表明滞育准备期是决定昆虫顺利进入滞育的关键时期,对滞育发生至关重要。目前20E在昆虫生殖滞育准备期发挥怎样的功能,及其分子调控机制尚不清楚。因此,本研究拟解决的科学问题是明确20E参与昆虫生殖滞育准备调控的途径和分子机制,为解决昆虫如何积累环境信息进而启动滞育程序这一核心科学问题奠定基础。大猿叶虫Colaphellus bowringi Baly是一种十字花科蔬菜害虫,具有生殖滞育特性,光周期和温度是诱导大猿叶虫进入生殖滞育的重要环境因子。大猿叶虫的各个滞育阶段明显,便于区分,是滞育调控机制研究的理想模型。25℃,长日照16L:8D条件可诱导大猿叶虫进入滞育,雌成虫卵巢发育完全停滞,卵巢管分化不明显,脂肪体中积累大量脂肪,几乎充满整个腹腔;在25℃,短日照12L:12D条件下,大猿叶虫雌成虫腹腔中充满卵粒并逐渐开始产卵,脂质积累较少。本研究以大猿叶虫为实验材料,揭示20E信号在大猿叶虫生殖滞育准备过程中的功能,探索20E信号对此过程中主要生理事件的调控机制。主要结果如下:1.20E信号对大猿叶虫生殖滞育准备的抑制作用本研究首先鉴定并克隆了大猿叶虫20E生物合成基因的序列,包括Spook（Spo）、Phantom（Phm）、Shadow（Sad）和Shade（Shd）,比较了滞育和非滞育雌成虫中20E滴度变化和20E合成基因的表达水平,进一步分析了20E信号在大猿叶虫生殖滞育准备中的功能,结果表明:（1）大猿叶虫20E合成基因均与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata亲缘关系较近,且4个20E合成基因均属于细胞色素P450超家族,含有CYP450经典特征基序。（2）20E滴度在滞育和非滞育雌成虫中存在明显差异,在后者体内呈现出较高水平,Spo、Phm、Sad和Shd在卵巢组织中特异性表达,且Phm、Sad和Shd均在非滞育雌成虫的产卵前期高表达。（3）向滞育雌成虫注射20E可诱导卵巢大小及卵黄生成量增加,同时甘油三脂含量和总酯含量显著下降。沉默非滞育雌成虫体内20E受体ecdysone receptor（Ec R）和20E合成基因Spo、Sad以及Shd后,卵巢发育严重受阻,而脂质含量明显增多。说明20E信号可抑制大猿叶虫的生殖滞育准备。（4）对滞育雌成虫20E处理后脂肪体组织RNA-sequence测序并结合文献报道筛选发现,20E可诱导Triacylglycerol lipase 1（TGL1）、Brummer（Bmm）、Acyl-Co A oxidase（ACO）等脂质分解基因上调表达;脂质合成相关基因如fatty acid synthase 2（FAS2）、transketolase 2（TKT2）、Alcohol dehydrogenase NADP（+）（ADH）等在20E处理后均表现出表达量下调。2.20E信号通过调节JH合成抑制大猿叶虫的生殖滞育准备前期研究表明低水平的JH是昆虫进入生殖滞育的内分泌基础,因此本研究分析了20E信号对JH合成的影响,利用激素拯救实验确定了20E可通过调节JH合成从而参与大猿叶虫的生殖滞育准备调控。研究结果显示:（1）滞育雌成虫20E处理后头部组织进行RNA-sequence测序发现,Insect hormone biosynthesis通路被显著富集。鉴定JH生物合成基因和JH滴度指示基因并绘制热图分析,其中11个JH合成基因和2个JH滴度指示基因的表达水平均在20E处理后显著增加。（2）注射20E可显著诱导滞育雌成虫体内JH合成的增加,沉默非滞育雌成虫Ec R基因减少了JH合成。JH合成及JH滴度指示基因的表达水平均在非滞育雌成虫沉默Spo、Sad以及Shd后显著下降。（3）滞育雌成虫沉默JH受体Met（Methoprene-tolerant）并注射20E后发现,20E无法诱导卵巢的发育,然而脂质含量仍然显著下降,暗示20E可直接（独立于JH）调节大猿叶虫的脂肪积累。此外,JH类似物处理可拯救非滞育雌成虫中沉默Ec R后的表型,主要表现为促进卵巢的发育和减少脂质的含量。上述结果表明,20E信号可通过促进JH合成诱导卵巢发育和抑制脂质积累,进而参与到大猿叶虫的生殖滞育准备过程,而20E信号对脂质的调节还存在独立于JH信号的未知途径。3.蜕皮触发激素ETH作为重要的调节因子参与了大猿叶虫生殖滞育准备中20E信号对JH合成的调控过程蜕皮触发激素（ecdysis-triggering hormone,ETH）可作为一个重要的中间调节因子,在昆虫变态和生殖过程中参与20E信号对JH的调控,但在昆虫生殖滞育中的功能尚不明确。本研究测定了ETH的组织和时间表达模式,分别检测注射20E和沉默Ec R后ETH的表达水平以明确20E信号对ETH的影响,分析了ETH信号对JH合成和生殖滞育相关表型的影响。结果表明:（1）ETH具有神经肽保守的结构特征:信号肽+成熟肽ETH1+成熟肽ETH2。（2）ETH在粘附气管的脂肪体组织中呈现出高水平表达,且在非滞育雌成虫的表达水平显著高于滞育雌成虫。（3）20E信号可诱导ETH的表达上调,JH III滴度,JH合成基因以及JH滴度指示基因的表达水平均在ETH RNAi处理组中显著下调。（4）沉默ETH后雌成虫的卵巢发育受到明显抑制,说明ETH可通过促进JH合成诱导大猿叶虫的生殖发生。（5）向滞育雌成虫体内注射ETH成熟肽后观察卵巢的发育情况发现,注射不同剂量的ETH成熟肽均对滞育雌成虫的卵巢发育无明显诱导作用。（6）ETH受体（ETH receptor,ETHR）的RNAi实验也导致了雌成虫卵巢发育受阻和JH水平降低。综上所述,ETH可以有效地激活JH信号进而促进卵巢发育,但不是JH介导生殖发生的必要条件。ETH信号可作为中间调控因子,偶联20E对JH合成的调控作用,进而参与大猿叶虫的生殖滞育准备。4.20E信号通过DNA复制调控大猿叶虫的生殖滞育准备本研究筛选出可能参与大猿叶虫生殖滞育发生并受到20E调控的其他关键信号通路,并对候选基因进行功能验证,结果表明:（1）对课题组前期获得的大猿叶虫滞育准备期和产卵前期全虫转录组文库的差异基因进行富集分析,发现DNA replication pathway被显著富集。同时对滞育雌成虫20E处理后脂肪体组织的转录组文库中的差异基因进行GO富集分析发现,DNA replication pathway也可被显著富集。（2）富集到DNA replication pathway的共同差异基因有14个,这些基因均与鞘翅目昆虫亲缘性较高。（3）14个DNA复制相关基因的表达水平均在滞育和非滞育雌成虫中存在明显差异,暗示DNA复制复制过程对大猿叶虫的生殖滞育发生具有潜在调作用。（4）沉默11个DNA复制相关基因后可阻止非滞育雌成虫卵巢的正常发育,卵黄原蛋白基因Vg1和Vg2的表达水平显著下降。（5）20E信号可促进DNA复制基因的表达上调。这些结果表明,20E信号可通过DNA复制调控大猿叶虫的生殖滞育准备。本研究发现了20E可响应生殖滞育准备阶段的光周期信号,首次揭示了20E信号在生殖滞育准备过程中的关键作用。同时发现了20E可通过调节JH合成进而决定生殖滞育发生。ETH可作为中间调控因子,偶联20E对JH合成的调控作用,明确了20E信号作为滞育发生上游调控因子的新颖功能。其中,20E信号对脂肪积累的调节还存在独立于JH的未知途径。此外,本研究还发现了20E信号还可通过DNA复制调控大猿叶虫的生殖滞育准备。这些结果为深入理解昆虫发育可塑性机制提供了新视角,同时为利用昆虫生长调节剂调控滞育发生进而控制害虫提供了新思路。