人结合珠蛋白cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达和鉴定

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目的:克隆人结合珠蛋白(haptoglobin,Hp) cDNA,并在大肠杆菌中表达和鉴定,纯化后作为抗原免疫小鼠。  方法:提取卵巢癌细胞株Hela细胞中的RNA,通过逆转录、PCR扩增Hp目的基因,将其分别与带有His标签的pET-32a及GST标签的pGEX-4T-1载体连接,转化DH5α菌进行基因克隆并测序鉴定。进一步构建表达体系,用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,最终在BL21菌中表达Hp融合蛋白(分别含有His-Tag和GST-Tag),并进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。获取目的蛋白后,进行纯化后作为免疫蛋白及检测蛋白,免疫小鼠并检测小鼠产生抗体情况。采用间接ELISA法测小鼠血清抗体效价。  结果:成功构建pET-32a-Hp、pGEX-4t-1-Hp工程质粒,获得两种标签的融合蛋白。将重组蛋白纯化后作为免疫原成功免疫小鼠且产生相应抗体。  结论:成功表达和纯化了两种标签的Hp融合蛋白,免疫小鼠后产生抗体,为进一步开发人Hp试剂盒奠定基础。
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