导电水凝胶的制备及对NSCs增殖与分化的影响

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神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases,ND)和创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)等对社会的影响越来越大。神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)可以通过自我更新并分化为中枢神经系统中的主要细胞类型来替代受损的神经细胞,而单纯移植的NSCs成活率较低。越来越多的研究显示,导电水凝胶可以提供NSCs生长所需的仿生骨架,并且一定强度的电磁信号对NSCs的增殖分化有促进作用。因此,基于组织工程原理,将NSCs培养于导电水凝胶内,同时施加外源电磁场(Electromagnetic field,EMF),有望传递或加强NSCs所处三维微环境中的电磁信号,利于NSCs的增殖与分化,从而实现修复或替代受损神经,达到治疗或明显改善疾病的目的。本论文首先提取13~16天胎龄的胎鼠大脑的NSCs进行体外传代培养,对第三代细胞进行免疫荧光鉴定、倒置显微镜下连续观察和生长曲线分析,结果表明所培养的细胞为NSCs,并且具有良好的细胞活力。实验选取第三代NSCs用于后续研究。接下来,以天然高分子材料羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMCS)和明胶(Gelatin,Gel)为基础,经冷冻干燥技术结合化学交联法制备了CMCS/Gel水凝胶,然后在氧化引发剂和掺杂剂的作用下,通过将不同摩尔量的3,4-乙烯二氧噻吩(3,4-ethylenedioxythiophene,EDOT)在水凝胶CMCS/Gel上原位聚合,进而获得了聚(3,4-乙烯二氧噻吩)(Poly(3,4-ethylenedioxythiophene),PEDOT),从而获得了CMCS/Gel-PEDOT水凝胶。同时对各组水凝胶(CMCS/Gel-0.1 EDOT、CMCS/Gel-0.15EDOT、CMCS/Gel-0.2 EDOT)的物理化学性能进行了测试,结果表明:各水凝胶孔隙率均可达到90%以上;溶胀率达到2919±48%及其以上并能保持稳定;扫描电子显微镜微观形貌观察显示,水凝胶的孔分布均匀,且孔径在100~250μm之间,孔与孔之间相互贯通;热重分析结果显示在200℃以下可以保持稳定,具有良好的热稳定性;体外降解实验表明各组水凝胶均可在2 mg/m L的溶菌酶溶液中缓慢降解,且CMCS/Gel-0.2EDOT水凝胶的降解率最低(六周的降解率为40.8±0.5%);力学性能测试显示水凝胶与鼠脑组织的应力-应变曲线极其相似并接近,均为粘弹性曲线;随PEDOT掺杂量的增加,水凝胶的电导率提高,CMCS/Gel-0.2 EDOT水凝胶的电导率为1.5×10-3 S/cm。进一步,以CMCS/Gel水凝胶为对照组,选取导电水凝胶CMCS/Gel-0.2 EDOT作为实验组,考察了导电水凝胶对胎鼠NSCs增殖与分化的影响。经CCK-8活性检测、死活荧光染色观察、HE染色形态观察、SEM粘附观察以及免疫荧光染色观察,结果发现:水凝胶CMCS/Gel与导电水凝胶均具有良好的生物相容性,均有利于NSCs的增殖与分化,其中相比水凝胶CMCS/Gel,导电水凝胶内的NSCs表现出更高的粘附率与增殖活性;除此之外,初步的电磁刺激实验表明,连续3天(30 min/day)施加交流电产生的EMF(1 m T,75 Hz)后,导电水凝胶内NSCs的增殖活性显著高于CMCS/Gel水凝胶内的NSCs活性。综上所述,本文制备了一种新型的CMCS/Gel-PEDOT导电水凝胶支架材料,具有良好的物理化学性能及生物相容性,结合外源的EMF,有效促进了NSCs的增殖与分化,有望作为理想的承载NSCs的移植材料和介电材料,为ND、TBI等疾病的治疗带来新的思路与途径。
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