[研究背景和目的]新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)是由于围产期窒息而导致的缺氧缺血性脑损害。HIBD可引起智力障碍、癫痫、运动缺陷、认知和学习障碍。目前新生儿HIBD发病率和死亡率仍较高,是全世界关注的一个健康问题。传统观念认为,中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤后不能修复,但人们近年对神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的研究发现,在大脑的某些部位如侧脑室的室管膜下区(subventricular zone, SVZ)和海马齿状回区(dentate gyrus, DG)终身存在着内源性NSCs,这两个区域被称为神经再生区。脑损伤可刺激体内神经再生区的NSCs增殖、分化,进行自我修复,但大脑的这种自身修复潜能有限,能够找到能促进大脑NSCs增殖的方法将为新生儿HIBD治疗带来希望。目前对新生儿HIBD的治疗仍是以“三对症”及“三支持”一般治疗为主,可以让患儿病情在急性期得到一定程度的缓解,但并不能阻止其神经系统后遗症的发生,所以,在加强支持治疗的同时,进一步寻求有效的治疗方法成为大家关注的焦点。近年来,随着人们对新生儿HIBD发病机制的不断深入研究,发现新生儿HIBD的发生与兴奋性氨基酸神经毒性、自由基氧化应激损伤、钙离子超载、细胞凋亡等有关,与之相关的一些治疗措施也随之逐渐出现。目前新生儿HIBD的治疗方法主要有：①亚低温；②高压氧(hyperbaric oxygenation, HBO);③NSCs移植；④神经保护药物。目前,亚低温被国际上认为是治疗新生儿HIBD的有效方法,被准予进入标准的临床研究,其它治疗方法的疗效仍需反复实验验证和进一步评估。HBO治疗是指机体处在超过1个大气压(1ATA)环境中呼吸纯氧的一种治疗方法。HBO在成年动物脑损伤模型及成人均有明显的治疗效果,但由于新生儿和成年人生理上的明显差异,目前国内外对HBO在新生儿临床的应用仍存在很大的争议。虽然国内有较多文献研究HBO对脑损伤的保护作用机制,报道HBO治疗对新生儿脑损伤有明显的疗效,但因为有些研究样本量偏小,随机分组方法不明确,HBO治疗压力和时间选择不一以及脑损伤程度不同,故研究质量参差不齐,缺乏足够有力的证据。神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是发现最早的一类神经营养因子,具有抗氧化、抗凋亡、抑制兴奋性氨基酸神经毒性、维持细胞内钙离子稳态等多种作用,可以保护效应神经元,促使损伤神经再生。研究证明,NGF可透过血脑屏障,为外源性NGF治疗新生儿HIBD提供了可能,但其对新生儿脑损伤的临床疗效有待进一步深入研究。巢蛋白(Nestin)是中间丝蛋白的一种,是胚胎NSCs的特征性标记,出生后表达便很快降低并消失,仅在少数保持神经发生功能的部位有表达。脑损伤后,伴随着炎性细胞的浸润、水肿和组织坏死,Nestin可以重新表达,是反映中枢神经系统损伤敏感标志物之一,且可反映内源性NSCs激活情况。5-溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine, BrdU)化学结构与DNA合成原料胸腺嘧啶脱氧核苷极为相似,可在细胞增殖周期的S期嵌入细胞核DNA中,且可在细胞核DNA中长期存留。因BrdU抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应,免疫组化染色可特异性显示BrdU阳性标记细胞,可观察BrdU在细胞内的掺入情况,且小于1%的正在合成DNA的细胞也能被检测出来,故BrdU也是反映神经细胞增殖再生的理想指标。Morris水迷宫(morris water maze)实验是一种让实验动物学习在水中寻找隐藏平台并通过分析其寻找平台所用时间和所走路径判断其记忆功能好坏的实验方案,是一种研究空间学习记忆的标准实验。足错误和肢体放置试验是常用的感觉运动功能测试方法。可通过对大鼠进行Morris水迷宫行为测定和感觉运动功能测试作为神经行为学的评价指标。本研究通过建立新生鼠HIBD模型来研究HBO和NGF对新生鼠HIBD的保护作用,通过反映新生鼠HIBD后神经细胞再生、神经干细胞激活指标的动态变化,结合Morris水迷宫实验动态监测新生鼠学习记忆功能,并进行足错误和肢体放置试验测试感觉运动功能,为临床上应用HBO和NGF治疗新生儿HIBD从神经细胞学和神经行为学上提供实验依据。[方法]选7日龄SD大鼠200只,通过结扎并剪断160只大鼠右侧颈总动脉,吸入8%O2+92%N2 2小时制备新生鼠HIBD模型,设置HIBD对照组、HBO治疗组、NGF治疗组和NGF+HBO治疗组,其余40只大鼠设为假手术组。BrdU标记CNS新生神经细胞,通过免疫组化方法和计算机图像分析技术检测五组大鼠不同时点(术后4天、7天、14天、21天)海马DG区Nestin和BrdU的表达变化及光镜下脑组织病理改变。生后30天(术后23天)做Morris水迷宫测试(定位航空试验和空间探索试验),历时6天,监测大鼠的学习和记忆能力。生后42天(术后35天)进行感觉运动功能测试(足错误和肢体放置试验)。[结果]1.新生鼠HIBD模型建立后早期神经行为改变各组大鼠在术前一切行为能力正常,假手术组大鼠无异常行为表现,HIBD组大鼠经历缺氧时出现严重的行为异常。2.脑组织病理改变假手术组大鼠脑组织结构无明显损伤性改变。HIBD对照组大鼠病变主要集中在皮层和海马的CA1和CA3区,锥体细胞层次减少、排列紊乱；术后4天出现胶质细胞增生,有炎性细胞浸润,神经元变性,核固缩呈强嗜碱性,部分神经细胞胞体缩小,结构模糊或消失,呈空隙状或有空腔形成,另外可见血管内皮细胞肿胀,血管周围间隙扩大,部分神经细胞核固缩、碎裂；术后7天星形胶质细胞增生较前明显,脑组织神经元大量坏死、崩解,网状及索条状瘢痕形成；术后14～21天部分神经元丢失,胶质瘢痕形成。HBO治疗组、NGF治疗组及NGF+HBO治疗组大鼠病理改变较HIBD对照组明显减轻,锥体细胞层次无明显减少,排列较松散,少量神经细胞核固缩、碎裂；NGF+HBO治疗组较HBO治疗组和NGF治疗组减轻更明显。3. Nestin表达五组大鼠海马DG区Nestin的表达均于术后4天达高峰,术后7-14天表达开始减弱,术后21天表达明显减少,不同时点比较差异有统计学意义(P<0.01)。各时点HIBD对照组Nestin日性细胞数较假手术组增加,比较差异均有统计学意义(P<0.05); HBO治疗组、NGF治疗组及NGF+HBO治疗组Nestin阳性细胞数均较假手术组和HIBD对照组明显增多,比较差异均有统计学意义(P<0.01)；各时点NGF治疗组Nestin阳性细胞数比HBO治疗组增加,但只有第21天两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；各时点NGF+HBO治疗组Nestin阳性细胞数比HBO治疗组增加,但只有术后4天(P<0.01)和21天(P<0.05)比较差异有统计学意义；NGF+HBO治疗组NestinP日性细胞数较NGF治疗组增加,但只有术后4天比较差异有统计学意义(P<0.05)。4. BrdU表达五组大鼠海马DG区BrdU的表达均于术后4天达到高峰,术后7～14天表达开始减弱,术后21天表达明显减少,不同时点比较差异有统计学意义(P<0.01)。各时点HIBD对照组BrdU阳性细胞数较假手术组增加,HBO治疗组、NGF治疗组及NGF+HBO治疗组BrdU阳性细胞数均较假手术组和HIBD对照组明显增加,比较差异均有统计学意义(P<0.01); NGF治疗组、NGF+HBO治疗组BrdU阳性细胞数增加均较HBO治疗组增加更明显,比较差异有统计学意义(P<0.01); NGF+HBO治疗组BrdU阳性细胞数较NGF治疗组略增加,各组差异比较无统计学意义(P>0.05)。5.水迷宫行为测定5.1定位航空试验连续5天试验假手术组、HBO治疗组、NGF治疗组及NGF+HBO治疗组大鼠逃避潜伏期均较HIBD对照组缩短,差异有统计学意义(P<0.01)；同时间点HBO治疗组逃避潜伏期均较假手术组延长,但只有第1、5天试验差异有统计学意义(P<0.05)；同时间点NGF治疗组和NGF+HBO治疗组逃避潜伏期均较假手术组延长,除第2天外,其他时间点均有统计学意义((第3、4天,P<0.05;第1、5天,P<0.01)；同时间点三个治疗组逃避潜伏期比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠的逃避潜伏期随日龄增加、游泳次数增多呈逐渐下降的趋势(P<0.01)。5.2空间搜索试验假手术组、HBO治疗组、NGF治疗组及NGF+HBO治疗组四组大鼠穿环指数均高于HIBD对照组,差异有统计学意义(P<0.01)；假手术组穿环指数高于三个治疗组,但差异均无统计学意义(P>0.05)；三个治疗组穿环指数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。6.感觉运动功能测试6.1足错误试验假手术组、HBO治疗组、NGF治疗组及NGF+HBO治疗组四组大鼠足错误次数左右差值均较HIBD对照组减少,差异有统计学意义(P<0.01)；假手术组足错误次数左右差值较三个治疗组减少,但差异均无统计学意义(P>0.05)；三个治疗组足错误次数左右差值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。6.2肢体放置试验假手术组、HBO治疗组、NGF治疗组及NGF+HBO治疗组四组大鼠肢体放置左右差值均较HIBD对照组减少,差异有统计学意义(P<0.01)；假手术组肢体放置左右差值较HBO治疗组减少,差异均有统计学意义(P<0.01)；假手术组肢体放置左右差值亦较NGF治疗组和NGF+HBO治疗组减少,差异均有统计学意义(P,0.05)；三个治疗组肢体放置左右差值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]1. HBO、NGF及NGF+HBO联合治疗均可减轻新生鼠HIBD后神经细胞的变性、坏死；2.新生鼠HIBD后海马DG区Nestin和BrdU的表达增加,可能与脑损伤后神经再生有关；3. HBO、NGF及NGF+HBO联合治疗均可增强HIBD新生鼠海马DG区Nestin和BrdU的表达,能够促进新生鼠HIBD后神经再生；4. HBO, NGF及NGF+HBO联合治疗均可改善HIBD新生鼠的学习记忆力和感觉运动功能。