论文部分内容阅读
基因治疗是利用内源性或外源性的遗传物质来改善细胞功能、杀灭病变组织或增强机体自身保护能力。基因治疗的策略主要有三种：物理导入、病毒载体及非病毒载体。相比前两种导入方式,非病毒载体无基因片段包载容量限制,低毒且无免疫原性、易于大规模生产及保存。然而非病毒基因的转染效率普遍较低,主要原因为血浆稳定性差、溶酶体滞留、包载/释放矛盾等,尤其是溶酶体滞留问题,导致基因在酸性环境中被大量破坏。非病毒基因载体往往利用阳离子聚合物的“质子缓冲效应”以破坏溶酶体,导致较高的细胞毒性。最近报道,有研究者通过组蛋白(H3)修饰聚乙烯亚胺,入胞后以非溶酶体途径抵达核周,获得了较高的转染效率且减小了毒性。这种基于细胞内部转运机制的非病毒载体设计的全新策略展示了很好的应用前景。本文构建了两种非溶酶体转运途径的非病毒基因载体系统：聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管及特殊FAL多肽修饰的阳离子脂质体。前者具有独特的理化性质,能够通过小窝蛋白介导的内吞途径实现内在化,该入胞机制能避免传统的溶酶体途径,实现良好的基因转染及基因治疗效果；后者利用一种阳离子多肽FL修饰普通的阳离子脂质体,实现安全高效的细胞内部转运方式。除溶酶体滞留问题,非病毒基因载体往往面临着“包载/释放矛盾”的问题。为了防止核酸在胞外过早释放以及保护核酸免受酶的破坏,非病毒基因载体需要同核酸紧密结合成稳定的颗粒。而一旦复合物抵达作用部位,过于致密的结构则不利于充分释放核酸。光热基因转染(photothermal transfection)是解决这一个问题的新策略。本文以光热吸收特性的碳纳米管为骨架材料,使用三种不同分子量的聚乙烯亚胺-胆固醇(PEI25K-Chol, PEI10K-Chol及PEI1.8K-Chol)物理修饰碳纳米管侧壁得到三种光热基因转染试剂——PEI-Chol/SWNTs(PCS25K,PCS10K, PCS1.8K)复合系统。通过红外光谱验证物理修饰的成功性,透射电镜显微镜、紫外可见吸收光谱及动态光散射法表征PCS复合系统的理化性质,琼脂糖凝胶电泳实验考察三种PCS与DNA的结合能力,发现PCS结合DNA的能力取决于聚乙烯亚胺的分子量,即PCS25K>PCS10K>PCS1.8K.三种PCS与DNA形成的复合物在体外具有明显的光热转换能力,NIR光刺激可导致DNA从复合物解离而被DNaseI酶降解,未受NIR激的复合物展现出良好的抗DNaseI酶能力。使用MTT法检测了PCS/DNA复合物对HEK293细胞、HeLa细胞的细胞毒性,发现当载体基因复合比相同时,PCS/DNA的细胞毒性略低于对应分子量的PEI/DNA.NIR刺激并未显著改变PCS/DNA的细胞毒性。将PCS用异硫氰酸荧光素(FITC)标记,DNA用花青染料荧光Cy3标记,两者荧光复合物用细胞流式仪及激光共聚焦考察在不同摄取抑制条件下的入胞情况,发现该复合物主要依赖小窝蛋白介导的内吞途径。经进一步的共定位实验发现,复合物内在化后能较大程度避免溶酶体途径,使得DNA具有良好的稳定性。并在近红外激光刺激下,观察FITC-PCS与Cy3-DNA的解离情况,再次验证NIR光能促进PCS与DNA的解离,但该行为并未在传统转染试剂1EI25K与DNA复合物中呈现。以pEGFP-C1为报告基因,进行体外光热转染实验发现,体外无激光刺激时三种PCS在HEK293中的转染能力为：PCS25K>PCS10K>PCS1.8K>激光刺激能提高PCS在HEK293, HeLa细胞中的绿色荧光蛋白表达水平。为了研究PCS的光热基因治疗领域的潜力,本文选择肿瘤抑制基因pTP53质粒,利用PCS10K介导,通过细胞周期、凋亡/死亡率、线粒体膜电位、核碎片、线粒体形态及凋亡蛋白检测,研究其对HeLa细胞的抑制能力及凋亡机制。此外,本文构建了乳腺癌移植瘤模型,通过肿瘤生长曲线、组织切片染色等评价PCS10K/pTP53复合物于体内的抑瘤效果。非溶酶体途径的阳离子脂质体通过引入特殊FAL多肽修饰普通的阳离子脂质体。首先,使用FAL多肽修饰二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG-NH2)得到产物DSPE-PEG-FAL,通过核磁共振谱、红外光谱研究,证明FAL多肽成功连接于DSPE-PEG,选用阳离子脂质2-二油酰基羟丙基-3-N,N,N-三甲铵(DOTAP),中性辅助脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)及DSPE-PEG-NH2同DSPE-PEG-FAL的混合物为膜材,采用薄膜分散法制备了FAL修饰的阳离子脂质体(Liposome-FAL)。以pEGFP-C1为报告基因,以]HEK293、 A549及MCF-7细胞为模型,使用荧光倒置显微镜观察Liposome-FAL转基因能力,发现含2.25%的DSPE-PEG-FAL的Liposome-FAL的转染效率远远高于无修饰的普通PEG阳离子脂质体(Liposome-Non)。使用乳腺癌移植瘤模型进行体内转染试验,发现Liposome-FAL体内转染效率略优于商业化转染试剂Lipofectamine2000,且肿瘤内亦呈现明显的绿色荧光蛋白水平。应用pTP53质粒为模型药物,用Liposome-FAL及Liposome-Non携载后进行抗肿瘤研究。Liposome-FAL/pTP53复合物能显著抑制乳腺癌肿瘤,且p53蛋白免疫组化结果显示其表达水平高于Lipofectamine2000/pTP53组,而Liposome-Non/pTP53复合物则无明显抑瘤作用。综上,FAL修饰阳离子脂质体显示了良好的基因转染及治疗能力。而基于非溶酶体途径机制设计基因载体的策略十分具有潜力。