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背景:2010年世界卫生组织(World Health Organization,WHO)估计全世界大约有4850万对夫妇(8～12%)患有不孕不育,其患病率因国家和地区而异,男性因素所致生育问题的分布在20%～70%之间,精子数量少、形态异常、运动能力差是与男性因素相关的常见原因。随着世界范围内男性不育症的不断增多,它已成为一个越来越引起临床重视的健康问题。目前西医治疗男性不育症主要方式为药物治疗、手术及辅助生殖技术,但是存在疗效不确定、造成侵入性损害、价格高,或伴随不良反应和其他高风险的问题,使得男性不育症患者寻求其他治疗策略。随着中医药研究的发展,中医药成为男性不育症治疗中重要的方法之一,提供了安全、有效的治疗选择。灵归方为中国中医科学院西苑医院男科经验处方,由仙灵脾、当归、熟地黄、山药等13味药组成,具有补肾、活血的功效,前期临床研究发现灵归方有提高弱精子症患者精子活动率的作用,但其具体作用机制不明,故设计本研究以阐明灵归方改善精子活动率的可能机制。实验分为两部分,第一部分为探索使用奥硝唑(Ornidazole,ORN)制备弱精子症动物模型,观察不同剂量(200,400,800 mg/(kg·d))的ORN对于雄性SD大鼠精子浓度、活动率的影响;第二部分为保护性实验,设置对照组、模型组、灵归方组、左卡尼汀组,综合评价灵归方对弱精子症模型大鼠精液质量、附睾左旋肉碱(L-carnitine,LC)含量、附睾肉碱转运蛋白(Carnitine/organiccation transporter2,OCTN2)的蛋白及mRNA表达水平的影响,并检测灵归方干预后大鼠血清性激素水平,附睾SOD、GSH-Px活性以及MDA含量,光学显微镜观察睾丸、附睾组织病理学变化。第一部分:ORN诱导弱精子症模型大鼠的研究目的:观察不同剂量的ORN灌胃对雄性SD大鼠精液质量的影响,以制备弱精子症模型大鼠。方法:将40只雄性SD大鼠进行编号,使用电子秤称重并详细记录。按照随机数字表法将其分为对照组、模型1组、模型2组、模型3组各10只,具体给药方法为:模型 1 组:200mg/(kg·d)ORN;模型 2 组:400mg/(kg·d)ORN;模型 3组:800mg/(kg·d)ORN;对照组:1ml/100g0.5%CMC-Na(由于 ORN 水溶性差,故采用CMC-Na溶解后灌胃)。按照1ml/100g体重进行给药,连续灌胃20天,观察大鼠一般情况变化,在末次给药24小时后用5%水合氯酸溶液(0.7ml/100g)进行腹部注射麻醉,水合氯酸溶液使用剂量为按照0.4ml/100g体质量进行计算,大鼠麻醉后,称体重,取睾丸及附睾分别称重,计算睾丸、附睾脏器系数,并取大鼠左侧附睾尾进行精子浓度和活动率(PR+NP级精子百分率)分析。结果:1.在实验进行过程中,由于灌胃操作导致模型3组1只大鼠死亡。对照组一般状态良好,饮食正常,体毛浓密,且有光泽,大小便正常,活动量大,较活跃,存在笼内打斗现象;与对照组比较,模型1组上述各项征象无显著下降,饮食无明显减少,饮水量相当,体毛正常,光泽度稍差,活动量未见减少,存在笼内打斗现象,精神可;模型2组较对照组上述征象有下降,饮食量减少,体毛较稀疏,体毛光泽度不及模型1组,活动量以及打斗现象无明显减少,精神尚可;模型3组较对照组上述指标有显著下降,饮食量减少,体毛稀疏,体毛光泽度明显降低且不及模型2组,活动量少,打斗现象减少,精神差。2.与对照组比较,模型1组大鼠体重,睾丸、附睾重量,以及睾丸、附睾脏器系数变化差异均无统计学意义(P>0.05);模型2组体重,睾丸、附睾重量以及睾丸、附睾脏器系数有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05);模型3组体重,睾丸、附睾重量以及睾丸、附睾脏器系数均下降,有统计学差异(P<0.05)。3.与对照组比较,模型1组与模型2组精子浓度改变无统计学差异(P>0.05),模型3组精子浓度下降(P<0.01);与对照组比较,模型1组(PR+NP)级精子浓度及精子活动率无统计学改变(P>0.05),模型2组、模型3组(PR+NP)级精子浓度及精子活动率均下降(P<0.01)。结论:1.200 mg/(kg·d)ORN灌胃20天对于大鼠体重,睾丸、附睾重量及脏器系数,精子浓度、(PR+NP)级精子浓度及活动率均无影响。2.400 mg/(kg·d)ORN灌胃20天,对大鼠精子浓度无影响,但可导致(PR+NP)级精子浓度及精子活动率下降,可用于制备弱精子症模型大鼠。3.800 mg/(kg·d)ORN灌胃20天可导致大鼠精子浓度、(PR+NP)级精子浓度及活动率均明显下降,可用于制备少弱精子症模型大鼠。第二部分:灵归方对ORN诱导的弱精子症模型大鼠附睾功能影响的实验研究实验一:灵归方对ORN诱导的弱精子症模型大鼠附睾LC相关通路的影响目的:观察灵归方对ORN诱导弱精子症模型大鼠精液质量、附睾LC含量,附睾OCTN2蛋白及mRNA表达水平的影响,揭示ORN诱导弱精子症模型大鼠附睾能量代谢障碍以及灵归方改善弱精子症大鼠附睾功能的相关机制。方法:将40只雄性SD大鼠进行编号,使用普通电子秤称重并详细记录。按照随机数字表法将其分为对照组、模型组、左卡尼汀组、灵归方组,每组各10只,具体给药方法为:对照组:1ml/100g 0.5%CMC-Na;模型组:400mg/(kg·d)ORN;左卡尼汀组:LC 100mg/(kg·d)+400mg/(kg·d)ORN;灵归方组:灵归方浓缩液,按 17.5g 生药/kg+400mg/(kg·d)ORN,连续灌胃 20 天,ORN 均为上午 8:00-9:00灌胃,干预药物为下午5:30-6:30灌胃。末次给药24 h后,5%的水合氯醛腹腔麻醉,剪开阴囊,取出实验大鼠右侧附睾,用于进行精子浓度及活动率检测;左侧附睾在(pH 7.2～7.4)0.01mol/LPBS缓冲液配制的4%多聚甲醛固定液中进行固定,用于附睾LC含量、OCTN2蛋白与mRNA表达的检测。其中高效液相色谱法测定附睾中LC含量,免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测大鼠附睾OCTN2蛋白表达,逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测大鼠附睾OCTN2 mRNA表达。结果:1.与对照组比较,各组精子浓度改变无统计学差异(P>0.05);模型组(PR+NP)级精子浓度及精子活动率下降(P<0.05)。与模型组比较,灵归方组与左卡尼汀组(PR+NP)级精子浓度及精子活动率升高,有统计学差异(P<0.05);灵归方组与左卡尼汀组比较,(PR+NP)级精子浓度及精子活动率差异无统计学意义(P>0.05)。2.与对照组比较,模型组附睾LC含量下降(P<0.05);与模型组比较,灵归方组与左卡尼汀组附睾LC含量升高(P<0.05);且左卡尼汀组附睾LC含量高于灵归方组(P<0.05)。3.与对照组比较,模型组OCTN2蛋白表达下降(P<0.05);与模型组比较,灵归方组、左卡尼汀组OCTN2蛋白表达升高(P<0.05);灵归方组与左卡尼汀组比较,OCTN2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。4.与对照组比较,模型组OCTN2 mRNA表达下调(P<0.05);与模型组比较,灵归方组、左卡尼汀组OCTN2 mRNA表达上调(P<0.05);灵归方组与左卡尼汀组比较,OCTN2 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.400mg/(kg·d)ORN连续灌胃20天可导致大鼠精子活动率下降,可能与抑制附睾OCTN2蛋白及mRNA表达,引起血浆向附睾LC转运减少,导致附睾LC含量下降有关。2.灵归方能够提高ORN诱导弱精子症模型大鼠(PR+NP)级精子浓度及精子活动率,可能与增加大鼠附睾LC含量有关。3.灵归方可以上调ORN所致弱精子症模型大鼠附睾中OCTN2蛋白及mRNA的表达,从而增加LC从血浆向附睾转运。实验二:灵归方对弱精子症模型大鼠血清性激素及附睾氧化应激反应的影响目的:观察灵归方对ORN所致弱精子症模型大鼠血清性激素水平,附睾SOD、GSH-Px、MDA的影响,进一步揭示ORN造成弱精子症模型大鼠的可能机制以及灵归方的保护作用。方法:分组及灌胃方式同实验一。股动脉取血,酶联免疫吸附试验法测定大鼠血清中FSH、LH、T含量,取右侧附睾组织制备成5%的组织匀浆,将匀浆3000rpm离心10min,取上清进行SOD、GSH-Px活性以及MDA含量的检测。左侧睾丸、附睾部分置于4%多聚甲醛固定,随后用于观察睾丸、附睾结构组织病理学变化。结果:1.与对照组比较,各组FSH、LH及T水平改变均无统计学差异(P>0.05)。2.与对照组比较,模型组附睾GSH-Px、SOD活性下降,MDA含量升高(P<0.05);与模型组比较,左卡尼汀组及灵归方组GSH-Px、SOD活性升高,MDA含量下降,均有统计学差异(P<0.01);灵归方组与左卡尼汀组相比GSH-Px、SOD活性以及MDA含量比较无统计学差异(P>0.05)。3.在显微镜下可见各组大鼠睾丸中各生精小管结构正常,管腔明显,整齐排列,大量精子及精子细胞充满生精小管管腔,形态正常;各级生精细胞结构完整,层次清晰,各级生精细胞分裂活跃,各细胞形态未见明显异常,各组之间的形态学差异并不明显;各组附睾组织形态学改变并不明显,管腔中可见大量的精子,模型组附睾管腔中可见少量脱落细胞成分。结论:1.400mg/(kg·d)ORN连续灌胃20天对雄性SD大鼠血清性激素水平,睾丸、附睾组织形态并无显著影响,但是会引起附睾GSH-Px、SOD活性下降,MDA含量升高,可能是导致大鼠精子活动率下降的原因之一。2.灵归方可以增加附睾SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量,减少ORN所致弱精子症模型大鼠附睾氧化损伤,维持正常的精子成熟环境。