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德谷胰岛素作为新一代长效基础胰岛素的代表,在临床上具有血药浓度平稳,给药时间和部位灵活等优点,有望作为广大糖尿病患者的首选药物。德谷胰岛素最初由丹麦诺和诺德公司研制,2015获得FDA批准。目前国内多家企业获得临床批件,但尚未有上市产品。本文针对德谷胰岛素的纯化、修饰工艺以及生物活性定量分析中的技术难点进行研发,以期得到价廉物美的德谷胰岛素产品。本文主要研究内容包括:1、通过对重组工程菌HS631/BL21发酵获得的包涵体溶液进行变性复性,获得可溶性蛋白溶液,然后利用膜超滤进行浓缩置换和阴离子层析技术分离纯化得到德谷胰岛素原前体。在此过程中,通过确定β-巯基乙醇的投料量以及蛋白复性时间,提高了变复性工艺中蛋白的复性效率;确定膜超滤工艺中膜孔径的选择及TMP控制条件,保证超滤收率>95%;确定阴离子层析工艺优化条件,使层析收率>90%,层析洗脱样品纯度>95%。2、在获得德谷胰岛素原前体的基础上,使用重组胰蛋白酶对德谷胰岛素原前体进行酶切,切除引导肽和C肽片段,并进一步利用阳离子层析技术分离纯化得到德谷胰岛素前体。在此过程中,通过对蛋白酶切条件的优化,提高酶切反应收率,降低副产物的生成,并对其中1个主要副产物(DTI-IP01)进行鉴定;对阳离子层析条件进行优化,确定合适缓冲液、上样载量、洗脱条件,使得最终层析收率达到90%以上,洗脱样品纯度95%以上。3、在获得德谷胰岛素前体的基础上,连接甲基十六烷二酰基-Glu(OMe)-Osu,并通过C8反相层析获得德谷胰岛素。在此过程中,通过对连接工艺中反应温度、pH值、投料比的研究,提高了连接效率,抑制了副产物的产生,经C8进一步纯化,德谷胰岛素纯度达到99%以上,并对工艺中残留的4个主要杂质(IDeg-IPO1、IDeg-IP02、IDeg-IP03、IDeg-IP04)进行了 鉴定。通过以上的研究,确立了德谷胰岛素的纯化工艺路线为:包涵体—蛋白变复性—超滤浓缩—阴离子层析(获得德谷胰岛素原前体)—蛋白酶切—阳离子层析(得到德谷胰岛素前体)—连接十六烷二酸—C8反相层析纯化(获得德谷胰岛素)。将上述实验确定的工艺进一步放大到生产规模(500L),连续3批生产的数据显示,德谷胰岛素纯化生产工艺稳定,产品质量良好。将生产获得的德谷胰岛素用小鼠血糖法和脂肪细胞摄取葡萄糖法在生物学活性上进行分析,并且与原研药Tresiba进行了比较。结果表明,3个批次的德谷胰岛素和2个批次的Tresiba在降低小鼠血糖活性方面无明显差异,同样在脂肪细胞葡萄糖摄取活性方面亦无明显差异,两者表现基本一致。