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黑色素(Melanin)是一类结构复杂的多酚类杂聚物,广泛存于细菌,真菌以及高等生物的生物体内。黑色素具有电子传递、抗紫外线辐射,抗氧化,抗逆环境、抗重金属毒害、预防免疫和提高病原菌毒力等多种生理功能,在农业生产、医药研发、食品添加剂和化妆品以及生物材料等方面都有着广泛的应用。Alteromonas stellipolaris LMG21856菌株是从南极大洋海水中分离的一株具有耐低温,高产黑色素的革兰氏阴性寡营养细菌,为了证明4-羟基苯丙酮酸加双氧酶(HPPD)为A. stellipolaris LMG21856菌株合成黑色素的关键酶,本实验扩增出A. stellipolaris LMG21856菌株的HPPD基因并在E. coli BL21(DE3)中表达；对E. coli BL21(DE3)/pET30a-AsHPPD菌株的次级代谢产物尿黑酸和黑色素进行鉴定。结果如下：(1)酪氨酸代谢通路分析。将基因库中已有的完整的Alteromonas种属的基因组提交到RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology server)数据库进行基因组注释,并利用KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库进行酪氨酸代谢通路分析,只有HPPD在Alteromonas种属的基因组注释结果中存在,而酪氨酸酶、漆酶和聚酮合酶都不存在。(2)构建E. coli BL21(DE3)/pET30a-AsHPPD表达菌株。利用PCR从A. stellipolaris LMG21856基因组中扩增得到一条1.5kb大小的DNA片段,该DNA可编码一条与Alteromonas种属的4-羟基苯丙酮酸加双氧酶相似度较高的由358个氨基酸组成的多肽链。将AsHPPD ORF引入到载体pET30a,构建重组表达菌E. coli BL21(DE3)/pET30a-AsHPPD, SDS-PAGE对诱导后的表达菌全细胞蛋白进行分析,检测到一条与预期分子量44kDa相符的蛋白,且诱导4h,表达量最高；通过Western Blotting和Ni-NTA对外源表达的AsHPPD分别进行鉴定和纯化。(3)肉眼观测E. coli BL21(DE3)/pET30a-AsHPPD和A. stellipolaris LMG21856菌次级代谢产物黑色素。表达菌株E. coli BL21(DE3)/pET30a-AsHPPD经过0.5mmol/L IPTG诱导7-8h,发酵液中开始产生红棕色水溶性色素,并随着诱导时间的延长不断加深,最终呈现红褐色,这一现象与A. stellipolaris LMG21856的黑色素产生过程。此外,当培养基中添加酪氨酸,可以明显提高色素的产量。(4)紫外-可见分光光度计检测E. coli BL21(DE3)/pET30a-AsHPPD和A. stellipolaris LMG21856菌次级代谢产物尿黑酸。利用紫外-可见分光光度计对E. coli BL21(DE3)/pET30a-AsHPPD和A. stellipolaris LMG21856菌株的发酵液进行190nm-800nm范围的全波长扫描检测,吸收光谱显示1)尿黑酸标准品水溶液在290nm处有最大吸收峰,且自氧化变黑后,在350nm处出现另一吸收峰；2)表达菌经诱导1～2h的发酵液在290nm波长处开始出现吸收峰,并随着诱导培养时间的加长,峰值不断增大,诱导培养7～8h后(开始有色素产生),在350nm处开始出现另一吸收峰,随着摇瓶培养,峰值不断增大,当色素产生达到一定程度后,290nm处吸收峰不断减小；3) A. stellipolaris LMG21856菌在达到稳定期后,发酵液在290nm处开始有吸收值并不断增大,但最大峰值在300nm附近,可能是由于脂多糖类代谢产物的羟基造成的红移现象；4)当色素产生后,吸收光谱也会在350nm处开始出现另一吸收峰,当色素产生达到一定程度,290nm处吸收值开始减小。(5)高效液相色谱(HPLC)检测E. coli BL21(DE3)/pET30a-AsHPPD和A. stellipolaris LMG21856菌株次级代谢产物尿黑酸。经HPLC检测,诱导4hE. coli BL21(DE3)/pET30a-AsHPPD菌发酵液上清和培养72h后的A. stellipolaris LMG21856菌发酵液上清液分别在7.066min、7.096min有洗脱峰,考虑培养基中一些盐离子和PH的干扰,可以判定该洗脱时间与尿黑酸标准品洗脱时间一致(6.996min), E. coli BL21(DE3)/pET30a-AsHPPD菌可以利用A. stellipolarisLMG21856菌的HPPD催化酪氨酸降解生成次级代谢产物尿黑酸。(6)薄层层析(TLC)分离与检测E. coli BL21(DE3)/pET30a-AsHPPD和A. stellipolaris LMG21856菌株次级代谢产物黑色素。通过薄层层析对E. coli BL21(DE3)/pET30a-AsHPPD和A. stellipolaris LMG21856菌代谢所产黑色素进行层析,黑色素都只能层析出三角型色素带,在紫外光检测线下,色素展开条带都具有吸光特性。