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血虚肝郁证是肝血亏虚所引起的肝失疏泄调达,既有肝经血分的亏虚,又有肝经气机的疏泄失常,是肝血虚与肝郁气滞并存的复合证候。主要的临床表现是：头晕眼花,面色萎黄,多梦健忘,妇女月经量少,两胁胀痛,情志抑郁,舌质淡紫,脉弦细等。血虚肝郁证常见于“虚劳”、“眩晕”、“郁证”、“胁痛”、“月经不调”等许多疾病当中。辨证论治是中医学的特色之一,证候是疾病发生和演变过程中某一阶段本质的反应。血虚肝郁证是中医证候的基本类型,可见于诸多疾病中,危害广泛。鉴于目前血虚肝郁证动物模型的研究尚未报道,我们在中医理论指导下,对符合中医证候特征的血虚肝郁证模型的复制进行了探索。白芍,味苦、酸,性微寒,归肝、脾经。有养血调经,敛阴止汗,柔肝止痛之功,既能养肝血,又能柔肝体,最能顺应肝之特性,为养血柔肝药的代表。养血柔肝解郁是白芍临床应用的一个重要特色。作为白芍主要成分的芍药苷是一种单萜类糖苷化合物,具有多种生物活性,可以升高放射线致血虚证小鼠外周白细胞数量,促进各种造血祖细胞的增殖；此外还有降低血粘度,抗血小板聚集,抗自由基损伤,抗氧化,抗神经毒性,神经保护和抗抑郁等多种作用。本研究采用血虚肝郁证候模型,研究芍药苷对外周血象、下丘脑-垂体-肾上腺轴和脑内单胺类神经递质的影响,探讨芍药苷对血虚肝郁证模型大鼠NO/cGMP信号通路的调节作用,从而揭示白芍养血柔肝的作用机制和物质基础。1文献研究本课题通过查阅、梳理、归纳文献资料,分别总结了血虚证和肝郁证动物模型的造模方法,造模原理及各自的特点,掌握了血虚证和肝郁证的现代研究现状,为血虚肝郁证动物模型的建立打下坚实的基础。2实验研究在检索古今有关血虚肝郁证的发病机理和常见的疾病种类及血虚证和肝郁证实验研究进展的基础上,建立血虚肝郁证候模型,结合白芍养血柔肝缓急止痛的特点,研究芍药苷对血虚肝郁模型的影响,进一步探究白芍的养血柔肝作用机制和物质基础。2.1辐照结合束缚应激致血虚肝郁大鼠证候模型的建立采用大鼠单笼饲养、辐照结合束缚21天造模,检测各组大鼠体重、外周血象并进行糖水实验、敞箱实验和跳台实验,测定血浆中ACTH、CORT,下丘脑CRH和大脑海马单胺类神经递质5-HT和DA等含量。结果显示模型组大鼠生长缓慢,外周白细胞、红细胞、血红蛋白下降明显(P<0.05),血浆中ACTH明显升高(P<0.05),CORT和下丘脑CRH含量有升高趋势,脑内单胺类神经递质5-HT和DA含量明显降低(P<0.05)。2.2芍药苷对血虚肝郁证大鼠HPA轴和单胺类神经递质的影响采用辐射结合束缚应激的方式造模21天。检测大鼠外周血象、体重,进行糖水实验、敞箱实验和跳台实验,造模结束后,各组动物麻醉取血,测定血浆中ACTH、CORT,下丘脑CRH mRNA表达和大脑海马单胺类神经递质5-HT和DA等含量。结果显示：与模型组相比,芍药苷组对大鼠外周红细胞和白细胞均有明显的升高作用(P<0.05),糖水消耗量明显增加(P<0.05),体重增长明显(P<0.05),旷场试验水平爬格和垂直爬格数目增多(P<0.05),跳台实验错误次数有减少趋势,反应时间有减少趋势,HPA轴中血清ACTH明显升高(P<0.05),CORT和CRH有升高趋势,大鼠海马5-HT和DA含量升高明显(P<0.05)。2.3芍药苷对血虚肝郁证大鼠一氧化氮及一氧化氮合成酶的影响采用辐射结合束缚应激的方式造模21天,应用格里斯法(Griess法)测定血虚肝郁大鼠大脑海马NO含量及芍药苷对其的干预作用,应用免疫组化法测定芍药苷对血虚肝郁大鼠海马组织iNOS和nNOS表达的影响。模型组海马组织NO含量升高,芍药苷能降低海马NO含量。病理结果显示,模型组神经元胞体收缩,染色质加深,细胞核染色深,核收缩呈三角形,核仁不明显,皮质中NO含量升高,海马中iNOS和nNOS表达增多,芍药苷组神经元细胞核无明显异常,神经元形态未见明显变化,降低海马中iNOS和nNOS的表达量。2.4芍药苷对血虚肝郁证大鼠NMDA受体NR1、NR2A和NR2B的表达的干预作用采用辐射结合束缚应激的方式造模21天,应用免疫组化方法测定芍药苷对血虚肝郁证大鼠海马CA-3区的NMDA受体NR1、NR2A和NR2B表达的影响,研究发现,模型组CA-3区的NMDA受体NR1、NR2A和NR2B的阳性表达增高,IOD值增高,给予芍药苷后,不同剂量芍药苷都能降低海马CA-3区的NMDA受体NR1、NR2A和NR2B的表达量。2.5芍药苷对血虚肝郁模型大鼠cGMP的影响采用辐射结合束缚应激的方式造模21天,应用免疫组化方法测定芍药苷对血虚肝郁模型大鼠海马CA-3区cGMP表达的影响,研究发现,模型组CA-3区的cGMP的阳性表达增高,给予芍药苷后,能降低海马CA-3区cGMP的阳性表达量。2.6结论通过上述实验研究,从血象、行为学、HPA轴和脑内单胺类神经递质及NO/cGMP通路等方面验证了辐照结合束缚应激造成的大鼠模型可作为中医血虚肝郁证的动物模型。白芍的养血柔肝作用机制可能与其有效成分芍药苷调节HPA轴和单胺类神经递质有关。在证实了白芍及有效成分芍药苷对血虚肝郁证大鼠模型确有疗效的基础上,我们又研究了芍药苷对NO/cGMP神经转导通路核心位点NO.cGMP以及iNOS、nNOS、NMDA受体NR1、NR2A和NR2B亚基的作用,认为芍药苷发挥神经保护的功能可能是通过降低血虚肝郁大鼠海马NO含量,降低iNOS和nNOS的表达,降低NMDA受体NR1、 NR2A和NR2B亚基的表达,降低模型组cGMP的表达,调节NO/cGMP途径实现。综上所述,本课题通过文献研究与实验研究两部分,结合白芍的养血柔肝功能进行了血虚肝郁证动物模型的建立,符合中医病因病机理论,不仅在症状表现和实验室检查方面与临床吻合,而且也与现代更深层面的研究结果相一致,可为血虚肝郁证的深入研究奠定基础。课题还从HPA轴的调节和脑内单胺递质含量等方面明确白芍及有效成分芍药苷对血虚肝郁模型确有调节作用,进一步研究芍药苷对NO/cGMP转导通路的重要位点NO, iNOS, nNOS, cGMP, NMDA受体NRl, NR2A, NR2B的调节作用,从而探讨芍药养血柔肝的物质基础和作用机理,对于研究中医证候实质、评价中药疗效和解释中药现代作用机制具有重要意义。