【摘 要】
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脂肪酶是一类高效的生物催化剂,且在食品加工中具有多种不同的作用。通过基因工程、发酵工程等手段开发脂肪酶是近年来的研究热点之一,但是工程菌表达脂肪酶时受诸多因素影响,分离纯化过程中酶活严重损失等情况普遍存在。因此,研究工程菌的生产性能及稳定性、优化酶的分离纯化过程以及对脂肪酶的应用方向及应用特性进行探究具有重要意义。本课题组前期研究获得了一株高产重组疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶（命名为PTL）的毕赤酵母工
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脂肪酶是一类高效的生物催化剂,且在食品加工中具有多种不同的作用。通过基因工程、发酵工程等手段开发脂肪酶是近年来的研究热点之一,但是工程菌表达脂肪酶时受诸多因素影响,分离纯化过程中酶活严重损失等情况普遍存在。因此,研究工程菌的生产性能及稳定性、优化酶的分离纯化过程以及对脂肪酶的应用方向及应用特性进行探究具有重要意义。本课题组前期研究获得了一株高产重组疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶（命名为PTL）的毕赤酵母工程菌GS115-PT。本研究首先评价了GS115-PT的遗传稳定性及其产酶性能,之后利用双水相萃取技术对PTL进行分离纯化,最后探究了PTL在面包体系中的应用特性。主要研究结果如下:（1）探究了GS115-PT的遗传稳定性及其产酶性能。将工程菌连续传代15代并取1、5、10、15代作为受检代次,结果显示,工程菌的菌落和菌体形态、目的蛋白分子量、目的基因序列均保持一致;拷贝数在连续传代过程中发生损失,由初始的64.99减少为17.80,最后稳定为7.00左右;同时,脂肪酶的酶活提高了约0.55倍,这表明拷贝数为7.00时有利于GS115-PT发挥产酶能力,菌株具备良好的遗传稳定性,可用于工业化生产。（2）优化了双水相系统分离纯化脂肪酶的条件,并对分离纯化前后PTL的酶学性质进行了测定与比较。以纯化倍数、酶活回收率为指标,对聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）/无机盐双水相系统中PEG的分子量及浓度、无机盐的种类及浓度、pH、NaCl等条件进行了优化,得出最佳条件为:PEG 6000浓度为20%（w/w）、K2HPO4浓度为10%（w/w）、pH 7.0、不加入NaCl。在此条件下,纯化倍数达到4.26,酶活回收率为94.6%。纯化后的PTL具有更高的热稳定性和更广泛的pH耐受性,60℃和70℃处理5 h后酶活分别剩103.4%和99.4%,pH 6.0～12.0条件下酶活均高于纯化前的PTL。（3）探究了PTL在面包体系中的应用特性。以面包比容、组织结构以及面包芯白度为指标,得出最佳用量为10～20 mg/kg。比较了PTL、商业脂肪酶Lipopan F BG（以下简称FBG）、化学面包改良剂双乙酰酒石酸单（双）甘油酯（Diacetyl tartaric acid ester of mono（di）glycerides,DATEM）对面包比容、质构、感官等指标的影响,并采用扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法（Head-space solid phase micro-extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometer,HS-SPME-GC-MS）分别对面团的面筋网络微观结构及面包芯风味物质进行了分析。结果表明,PTL能使面包硬度显著降低,对内聚性和回复性也有一定程度的改善;在增大面包比容、强化面筋结构、提高感官整体接受度等方面,FBG效果最好,PTL次之,DATEM较差;FBG、PTL能够增加风味物质的种类,而加入DATEM产生大量乙酸掩盖了面包的香气;感官评定方面,PTL组面包在气味及组织结构方面得分最高。综上表明,适量PTL能有效改善面包的烘焙品质且具有不同于FBG的独特优势。
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