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目的:世界范围内,乳腺癌和卵巢癌是女性两大常见的恶性肿瘤。乳腺癌的发病率位居首位。然而,卵巢癌的死亡率远远超过乳腺癌,对女性生命安全造成严重威胁。从临床实践的角度来看,乳腺癌及卵巢癌诊断和治疗难点可以归结为以下三个方面:高度的异质性;缺乏高敏感性和高特异性的早期诊断及预后标志物;放疗及化疗药物的抵抗。近年来,随着基因芯片和高通量测序技术及相应的生物信息学分析方法的蓬勃发展,肿瘤病因及发病机制的研究已经深入分子水平。我们坚信,基于生物大数据的癌症标志物筛选以及基于药物基因组的药物发现能为乳腺癌及卵巢癌的早期诊断和治疗提供理论基础。Wnt/β-catenin信号通路广泛地参与胚胎发生、发育及干细胞稳态等正常生理过程。然而,Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的功能异常在众多疾病(尤其是恶性肿瘤)被广泛地报道。Dickkopf家族(Dickkopfs)成员包括DKK1、2、3、4和DKKL1,普遍被认为是Wnt/β-catenin信号通路的内源性拮抗剂。然而,Dickkopfs在乳腺癌分子亚型及卵巢癌中的异常表达及调控机制尚未完全得到阐明。因此,本研究拟通过生物信息学方法分析Dickkopfs在乳腺癌PAM50分型中的m RNA表达水平及预后价值,然后采用相对应的生物实验验证生物信息学分析结果。除此之外,本研究通过基于课题组先前工作基础以及采用生物信息学和生物实验相结合的方法来探索Dickkopfs在卵巢癌中的表达水平及对卵巢癌凋亡的影响。方法:(第一部分)首次,利用GOBO(Gene expression-based outcome for breast cancer online)数据库分析Dickkopfs在乳腺癌PAM50分型中的m RNA表达水平及与各亚型的总体生存率(Overall survival,OS)和无复发生存率(Relapse free survival,RFS)的关系。其次,利用METABRIC(Molecular taxonomy of breast cancer international consortium)、TCGA(The cancer genome atlas)乳腺癌转录组数据及q RT-PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction)实验验证Dickkopfs在乳腺癌PAM50分型中m RNA表达水平;最后,利用METBRIC和Kaplan-Meier乳腺癌转录组数据联合临床样本数据验证Dickkopfs m RNA表达水平与各亚型OS和RFS的关系。(第二部分)本研究下载TCGA卵巢癌组织和GTEx(Genotype-tissue expression)中正常卵巢组织的转录组数据(UCSC Toil RNAseq Recompute数据集);利用DEseq2包执行差异表达分析来筛选卵巢癌差异表达基因;利用Fun Rich v3.1.3(Functional enrichment analysis tool)对卵巢癌差异表达基因进行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析;利用GSEA3.0(Gene set enrichment analysis)执行单基因集富集分析;利用SPSS 22.0分析DKK3 m RNA表达水平与卵巢癌患者病理特征的相关性;利用Med Calc 18软件采用ROC(Receiver operating characteristic curve)方法分析Dickkopfs m RNA表达水平对卵巢癌诊断的敏感性和特异性。随后,本研究分别从GDSC(genomics of drug sensitivity in cancer)和Drugbanks数据库下载的卵巢癌细胞转录组数据及化疗药物敏感性数据和化疗药物的结构文件;利用SPSS 22.0分析DKK3 m RNA表达水平与化疗药物敏感性数据的相关性;利用i-TASSER基于蛋白折叠的方法构建DKK3蛋白三维结构;利用SAVES 5.0评价DKK3蛋白结构;利用Galaxy Refine web server对预测的DKK3蛋白结构进行修正;利用POCASA预测DKK3蛋白活性口袋;利用Autodock 4.3基于半柔性对接方式对DKK3蛋白与候选化疗药物进行分子对接;利用Pymol 2.3用来可视化蛋白三维结构及对接结构。最后,本研究选择人卵巢癌细胞系CAOV3、OVCAR3和SKOV3作为实验对象。采用Western蛋白印迹检测卵巢癌细胞系中DKK3蛋白表达水平;利用pc DNA3.1-DKK3质粒转染卵巢癌细胞系过表达DKK3蛋白;利用CCK8实验分别检测DKK3过表达对卵巢癌细胞活力和药物敏感性;利用基于cleaved caspase-3的Western蛋白印迹技术检测DKK3过表达对卵巢癌细胞凋亡。结果:(第一部分)GOBO表达模块结果表明,除DKK1外,Dickkopfs其他成员在乳腺癌Normal-like亚型中的m RNA水平均显著上调。其次,GOBO生存分析模块结果表明,在乳腺癌(不区分亚型)中,与DKK2 m RNA低水平组相比,DKK2m RNA高水平组具有更高的总体生存率和无复发生存率。然而,在乳腺癌Normak-like亚型中,与DKK2 m RNA低水平组相比,DKK2 m RNA高水平组表现出更低的总体生存率和无复发生存率。METABRIC、TCGA、q RT-PCR以及Kaplan-Meier数据集验证了DKK2 m RNA在乳腺癌PAM50中的表达情况以及在Normal-like分型中的临床预后价值,并且这一结果与GOBO数据库一致。(第二部分)本研究基于课题组先前的工作基础,通过卵巢癌差异表达分析挖掘出了DKK3作为卵巢癌预后相关的候选基因。生物信息学结果显示,与正常卵巢组织相比,DKK3 m RNA在卵巢癌组织中显著下调。其次,DKK3 m RNA水平在卵巢癌组织中低表达与DKK3基因启动子高度甲基化和拷贝数缺失密切相关;DKK3 m RNA水平与卵巢癌患者临床病理特征关联分析提示,DKK3 m RNA表达水平在卵巢癌不同的发生位置有明显差异;基于DKK3 m RNA水平的单基因GSEA结果表明,在DKK3m RNA高水平的卵巢癌中TGF-β/Smad4通路相关的基因显著富集。ROC结果表明DKK3 m RNA水平可以作为卵巢癌诊断标志物;DKK3 m RNA水平与化疗药物相关性分析结果显示,DKK3 m RNA水平与28种化疗药物敏感性(IC50)呈现负相关;KEGG富集结果表明在卵巢癌中上调的差异表达基因主要参与DNA复制、细胞分裂等通路;通过DKK3 m RNA水平与药物IC50的相关性分析以及卵巢癌差异表达基因的通路筛选,我们获得了候选化疗药物,包括顺铂(Cisplatin)和博来霉素(Bleomycin)。蛋白建模及分子对接结果提示DKK3蛋白三维结构上存在顺铂(Cisplatin)的结合位点。Western蛋白印迹结果显示,DKK3在卵巢癌细胞系CAOV3、OVCAR3和SKOV3中的蛋白表达水平依次降低。CCK8活力实验显示,与对照组相比,DKK3过表达的OVCAR3和SKOV3的细胞活力显著下降。基于cleaved caspase-3的Western蛋白印迹结果显示,与对照组相比,DKK3过表达的OVCAR3和SKOV3的细胞凋亡显著增加。除此之外,Western蛋白印迹结果显示,与对照组相比,在DKK3过表达的SKOV3中,Smad4蛋白水平显著升高。CCK8药物敏感性实验结果表明,与对照组相比,DKK3过表达的OVCAR3和SKOV3对顺铂的敏感性增强。结论:DKK2 m RNA在乳腺癌Normal-like亚型中显著上调,且DKK2 m RNA水平与乳腺癌Normal-like亚型的总体生存率和无复发生存率呈现负相关。DKK3过表达能够降低卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞活力并促进其凋亡。另外,与对照组相比,在DKK3过表达的SKOV3细胞系中,Smad4的蛋白水平明显升高,提示DKK3可能通过增加Smad4的表达水平进而参与TGF-β/Smad4通路从而调控卵巢癌细胞系凋亡。另外,DKK3过表达能够改善卵巢癌细胞系OVCAR3和SKOV3对顺铂的敏感性。综上,DKK2可作为乳腺癌Normal-like的预后标志物。DKK3可作为卵巢癌诊断和药物治疗敏感性的标志物。