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大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)是中国特有的珍稀动物,其濒危现状在世界范围内引起高度关注。了解大熊猫的种群数量、种群遗传背景对制定合理的保护措施非常必要。本研究尝试使用分子手段对野生大熊猫进行个体识别,以探讨大熊猫种群数量调查方法;同时利用mtDNA控制区序列和微卫星(Microsatellite)作为分子标记,对大熊猫的遗传多样性、种群遗传结构和种群历史进行探讨,得到如下研究结果。
(一)通过非损伤性遗传取样法对野生大熊猫的个体识别
1.文中提出了一种新的粪便DNA抽提途径,通过对15种动物的68份粪便样品的DNA抽提和扩增结果的验证,以及与国际通用的粪便DNA提取试剂盒(QIAampDNAStoolMiniKit)的实验结果进行比较,证明了这是一种经济、高效且广泛适用的粪便DNA抽提方法。
2.使用7对微卫星标记和性别标记,通过粪便DNA途径成功地进行了野生大熊猫的个体识别。通过对小相岭山系的11个粪便样品的分析,确定了这些样品来自6个个体,包括2雌4雄。对来自邛崃山系宝兴青山沟地区的67个粪便进行分析后,从48个样品中共发现了8个个体(6雌2雄),该结果与使用咬节判定法的个体数量统计结果一致。研究证明,通过粪便DNA和微卫星标记进行野生大熊猫个体识别非常有效,为野生大熊猫种群数量调查提供了一种新的方法。
(二)大熊猫种群遗传学研究
1.通过对5个种群179个大熊猫个体的655bpmtDNA控制区序列分析,发现了18个变异位点(16个转换、2个颠换),共定义了38个单倍型,线粒体基因多样性(H)和碱基多样性(p)分别为0.935和0.0049。在104个大熊猫个体的12个微卫星位点的分析结果中,发现平均等位基因数(A)为14.83±3.97,而基因多样性(Ho)则为0.507±0.015。上述结果说明了大熊猫现生种群没有表现出遗传背景的贫乏,仍然保持较为丰富的遗传多样性。五个大熊猫种群的mtDNA和微卫星分析结果的比较表明,岷山种群和邛崃种群遗传多样性水平较高,秦岭种群居中,而凉山种群和小相岭种群较低。
2.mtDNA控制区的分子变异分析(AMOVA)表明,种群间最简约的遗传区划为[秦岭][岷山-邛崃-凉山][小相岭](φCT=0.070,P<0.001)。微卫星分析结果则表明,邛崃种群和周围的岷山、凉山、小相岭种群之间在近期还存在着丰富的基因流,而秦岭种群与其它种群之间的基因交流可能在几千年来由于人类活动的影响而受到阻碍。综合上述分析结果,提示保护工作中应将秦岭种群与其它种群列入两个不同的管理单元。
3.利用棕熊线粒体控制区11-14%每百万年的分歧速率(Waitsetal.1998),估算出大熊猫最近共祖时间(TMRCA)为19.6-25万年,其可能来自晚更新世的庐山冰期的孑遗。通过嵌套枝分析(NestedCladeAnalysis,NCA),显示大熊猫种群还受到第四纪最后一次冰期的影响而产生了种群片断化,在最后一次冰期全面消退后,大熊猫种群又经历持续的种群扩散,其扩散范围从岷山、邛崃而至秦岭、相岭地区。受种群历史和近期栖息地骤减的共同影响,大熊猫mtDNA没有形成明显的地理系统格局,而利用微卫星数据对大熊猫种群近期动态的分析则显示,岷山种群由于经历了近期的瓶颈和栖息地片段化的影响,种群内的近交影响程度相对已经比较明显(EIS=0.37),而秦岭和邛崃种群数量下降并不明显。
研究结果表明遗传因素并非是导致大熊猫濒危的主要原因,而近期人类活动的影响才是导致大熊猫濒危的主因,提示今后大熊猫保护工作的重点应该以对栖息地的保护和恢复为主。