福建山羊卵巢cDNA文库构建及产羔性状相关基因多态性分析

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:tai314
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本试验选用福建闽东山羊、戴云山羊和福清山羊为试验样本,提取福清山羊卵巢组织的总RNA和3种山羊的全血DNA,设计了2个试验:试验一,运用SMART技术与DSN均一化技术,建立福清山羊卵巢组织的均一化全长cDNA文库。通过EST测序方法对选定的单克隆进行全长测序,对序列进行生物信息学分析,为进一步筛选与山羊繁殖力相关的功能基因提供条件;试验二,运用PCR-SSCP、PCR-RFLP分子标记技术,对5个与繁殖性状有关候选基因(BMP15、GDF9、LH-β、GnRHR、BMPR-IB)进行SNPs多态性检测,运用最小二乘方差分析法进行显著性检验,为5种基因的基因多态性与产羔性状的相关性研究提供理论参考依据。试验结果如下:1、建立了福清山羊卵巢组织均一化全长cDNA文库。经计算福清山羊卵巢原始文库滴度为1.0×10~6pfu/mL,重组率为99%,后经菌落PCR验证,克隆片段大小分布在0.5-2kb之间。随机挑取200个阳性克隆进行EST测序,利用Phred软件对200条ESTs去除载体序列、污染和小片段序列,获得183个长度大于500bp的有效序列。其中有显著同源性的序列164条,未知功能序列为19条。用Phrap软件进行序列拼接,得到156条Unigenes,其中跨叠群(contigs)7个,单条序列(singleton)149条,文库冗余率为14.8%,对同源序列进行Blast2Go功能分类,大致分为3类,包括与细胞组成相关序列、与分子功能相关序列、与生物过程相关序列。2、用PCR-SSCP以及PCR-RFLP方法对BMP15、GDF9、LH-β、GnRHR、BMPR-IB五种基因进行多态性分析,用最小二乘法分析五个基因不同基因型与产羔数之间的关系,结果表明:BMP15基因2个突变位点均对山羊的产羔性能产生影响。其中C6260G突变,突变杂合子CG型个体普遍具有较高的产羔数约1.74头,比CC型多0.3头差异不显著(P>0.05),比突变纯合子GG型多0.6头差异显著(P <0.05)。G6353A突变GG型平均产羔数1.85头,比AG型多0.2头,比AA型多0.5头且差异显著(P <0.05)。可初步估计BMP15基因能够作为福建本地山羊品种的产羔性状候选基因。GDF9基因对山羊群体产羔数性状的影响效应不显著,A1673C突变产生的3种基因型频率虽然有差异但总体分布正常,各基因型个体间的产羔均值差异不显著(P>0.05)。LH-β基因外显子2的C1187T突变,其中CC型个体数量较少。从最小二乘分析结果上看,该突变对山羊产羔性状有极显著的影响效应。突变杂合子CT和突变纯合子TT个体产羔数均高于野生型个体CC平均产羔数,且差异极显著(P <0.01)。初步判断该基因可作为繁殖力候选基因进行下一步研究。GnRHR基因的G757A突变,突变纯合子AA产羔数明显低于AG和GG型个体,差异极显著(P <0.01)。可初步判定G757A突变对福建山羊产羔数有一定的影响。BMPR-IB基因的A1762G突变对山羊产羔数性状的影响较小。突变产生的3种基因型个体之间平均产羔数差异不显著(P>0.05),但都能达到1.6头以上水平,突变杂合子产羔数相对较高。
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