椎间盘退变(intervertebral disc degeneration, IDD)是引起椎间盘突出症(lumbar intervertebral disc protrusion, LIDP)等椎间盘退行性疾病(discdegenerated disease, DDD)的主要原因,其发病机制较为复杂。目前认为IDD主要是细胞因子、营养代谢、遗传、生物力学等因素共同作用的结果。在退变早期,髓核(nucleus pulposus, NP)和纤维环(anulus fibrosus, AF)分界逐渐模糊,纤维环细胞密度有所增加,髓核内细胞聚集,椎间盘内细胞增殖、群集和死亡增多；软骨终板裂缝、变薄、软骨下骨微骨折和骨硬化。随着终板的硬化,软骨终板的血运通道、纤维环的血管逐渐减少,直接影响通过终板的营养途径。营养供给的减少限制了椎间盘髓核细胞合成新的基质,髓核组织内氧供的减少使髓核细胞进行无氧代谢、产生乳酸产物,而且代谢产物难以从无血管的椎间盘内排出,乳酸聚集使细胞外环境变为酸性,这是适宜于蛋白酶作用的环境。蛋白酶是参与老化和退行性变的重要因素,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)引起细胞外基质降解。胶原酶(CollagenasesMMP1,8,13)、白明胶酶(gelatinases MMP2,9)和(stromelysin, MMP3)降解椎间盘大多数胶原质、蛋白多糖(proteoglycan, PG)和连接蛋白(connexin, CN)。随着退变的进展,髓核逐渐脱水化,高度降低,细胞数量减少,蛋白含量明显降低。纤维环逐渐失去正常板层排列,板层数目减少。在退变晚期阶段,椎间盘变薄、弹性降低,髓核和纤维环的边界不清。髓核膨胀压降低,纤维环硬度增加,分散负荷的能力降低,使转移到骨的应力增加。纤维环裂隙和撕裂的数量和程度增加,纤维环在应力下不能包含限制髓核,致使椎间盘疝出,肉芽组织和神经血管从纤维环外层向内长入。IDD主要生化改变为蛋白多糖和水分减少、髓核细胞凋亡、纤维环老化变性、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)降解和纤维化、加速退变的细胞因子出现等一系列级联反应(cascade reaction)。正常椎间盘细胞通过各种途径调节代谢活动,其中影响椎间盘退变主要包括四个因素：①促进基质分解的因素如炎症因子、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等,如一氧化氮(nitrogen monoxidum, NO)-.白细胞介素(interleukin, IL)-1,6、肿瘤坏死因子a (tumour necrosis factor,TNF-α)、前列腺素E2、MMP3、环氧化酶2、蛋白聚糖酶(ADAMTS-4,属于MMPs家族)等；②抑制基质分解的因素如基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP);③促进细胞分裂的因素如血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF),细胞生长因子；④促进软骨形成因素如转化生长因子(transforming growth factor, TGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、成骨蛋白-1(OP-1)等；分子调节因子如Sox-9等。ECM分解代谢的增加促进了椎间盘细胞的加速衰老(aging)和凋亡(apoptosis),从而加速了IDD进程。椎间盘退变过程中最显著的特征是髓核细胞凋亡、蛋白多糖及Ⅱ型胶原(collagen typeⅡ, Col.Ⅱ)减少、Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ, Col.Ⅰ)增多。如何抑制和延缓椎间盘细胞凋亡、增加退变椎间盘ECM中的蛋白多糖以及Ⅱ型胶原含量,达到抑制、延缓或者治疗椎间盘退变是临床共同关注的问题。研究报道直接向椎间盘内注射细胞因子、椎间盘细胞、间充质干细胞(mesenchyme stem cell, MSC)等能够延缓或逆转椎间盘细胞的退变。有学者进行了将外源性生长因子的编码基因转入动物椎间盘的一系列体外和体内实验研究。Nishida等应用腺病毒载体将人TGF-β1基因转导入新西兰兔椎间盘中,发现TGF-β1浓度比对照组高出约5倍,合成的蛋白多糖量也较对照组高出1倍。Yoon也发现TGF-β1基因腺病毒可显著提高Ⅱ型胶原(collagen typeⅡ, Col.Ⅱ)及蛋白聚糖(proteoglycan, PG)的含量。因为椎间盘细胞为非分裂细胞,故实验中应用介导目的基因转入的载体为质粒型病毒载体如腺病毒。目的基因的选择：主要为具有促进蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成的作用的转化生长因子(transforming growth factorβ1,TGF-β1)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein)、胰岛素样生长因子((insulin-like growth factor, IGF-1))、SOX9等。人的端粒(telomere)DNA序列为(TTA GGG)n,重复次数为2000次左右,长度在4-14 kb之间。因为细胞每分裂1次,端粒丢失50～100 bp,随着分裂次数增多细胞染色体端粒越来越短,当端粒缩短到一定限度即不能维持染色体的稳定时,细胞进入增殖衰竭期,进而衰老死亡。因此在正常真核细胞中,端粒被认为是细胞寿命的“生命时钟”。影响端粒长度的因素包括：端粒结合蛋白(telomere binding protein)、端粒帽蛋白、端粒酶(telomerase)及DNA复制酶等,其中端粒酶是最主要的因素。当端粒的长度缩短到特定范围时,端粒酶活性成为关键因素。端粒酶活性可作为人类体细胞衰老标志之一。端粒酶是一种反转录酶,能以自身RNA为模板,不断合成端粒DNA序列添加到染色体末端,催化端粒DNA的复制和延长,阻止端粒缩短。端粒酶是由端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR),端粒酶相关蛋白(human telomerase Protein1, hTEP1又称TP1)和端粒酶催化亚基(human telomerase reverse transcriptase, hTERT又称hTRT、hTEST2或TP2)3部分组成的蛋白质复合物。端粒酶的主要功能是通过其逆转录酶活性复制和延长端粒DNA来稳定染色体端粒DNA的长度；另一功能是能修复断裂的染色体末端,维护基因组遗传的稳定性。hTERT是端粒酶的催化亚基,位于5p15.33,为一单拷贝基因,长度约为4kb (4027bp)。hTERT基因只在端粒酶活性阳性的细胞,如生殖细胞、各种具有分裂分化能力的组织干细胞和绝大多数的肿瘤细胞中表达。hTERT的表达与端粒酶活性呈正相关,端粒酶活性主要由hTERT表达水平的高低决定,因而hTERT是端粒酶活性的主要决定因素。因为端粒酶可以延缓细胞的衰老和凋亡,端粒酶基因用于防治椎间盘退变尚未见报道,本实验采用体内和体外实验,通过腺病毒将hTERT基因导入椎间盘细胞内,以在动物、细胞和分子水平探讨hTERT基因延缓椎间盘细胞衰老并进一步延缓椎间盘退变的作用及其分子机制。1、端粒酶基因腺病毒质粒的构建1.1、构建hTERT基因腺病毒载体设计引物,以带hTERT基因的质粒为模板,用PCR技术扩增出hTERTcDNA,扩增出来的基因经过BglⅡ/SalⅠ双酶切,链接到PIRES2-EGFP载体上设计两端带attb的引物,扩增出hTERT-PIRES2-EGFP基因。将电泳条带切胶回收,纯化,然后重组到pDONR222载体。重组的质粒转化到DH5a细菌,摇菌,抽提质粒,然后再重组到pAd腺病毒载体用于腺病毒包装。1.2、腺病毒包装、扩增、纯化重组质粒pAd-hTERT PacI线性化,线性化质粒转染293AD细胞,直至80%有病变(CPE)出现,收集细胞,反复冻融法获取病毒。在293AD细胞中扩增病毒,终点稀释分析法(end-point dilution assay)测病毒滴度,达到2.1×1012pfu/ml。扩增的病毒用CsCl连续梯度离心纯化。2、建立椎间盘退变模型2.1、在CT引导下构建椎间盘退变模型18只新西兰大白兔,每组6只,分别在穿刺后第4、8和12周检测,在同-动物体内同时设计对照组(CON组,L3/4)、假手术组(Sham组,L4/5)和穿刺组(Stab组,L5/6)。大白兔在应用速眠新和阿托品镇静,戊巴比妥钠静脉麻醉成功后,左侧卧位放在X线工作台上拍摄腰椎侧位片；在MRI工作台上,应用人体膝关节检测线圈检测新西兰大白兔腰椎和脊髓的T1加权像以及T2加权像。在CT引导下,用18G注射针头经皮穿刺进入椎间盘髓核,CT扫描确定针尖达到椎间盘髓核中央,反复穿刺3次,退出的针尖管内可见胶冻样髓核组织。CON组不进行任何穿刺,Sham组中的针尖穿刺至纤维环最外侧边缘而不穿刺进入椎间盘内。2.2、椎间盘退变模型的鉴定X线片观察椎间盘终板硬化、骨赘形成、测量椎间隙高度(intervertebral disc height, IDH)变化；MRI评估椎间盘退变信号程度,鉴定椎间盘退变模型构建成功,符合退变椎间盘大体观和组织病理学变化,免疫组化、Western Blot检测到退变椎间盘中Ⅱ型胶原比对照组明显减少,木瓜蛋白酶消化二甲基亚甲蓝染色法检测到退变椎间盘中蛋白多糖含量比对照组明显减少。3、hTERT阻抑髓核细胞衰老3.1、原代培养髓核细胞用消化法原代培养髓核细胞,取大鼠椎间盘组织,用胰蛋白酶初消化、再用Ⅱ型胶原酶消化椎间盘组织,获得类圆形的髓核细胞。3.2. hTERT腺病毒(hTERT-Ad)转染髓核细胞原代髓核细胞培养至第3-5代,用构建好的hTERT-Ad转染髓核细胞(hTERT-Ad组),没有转染病毒的细胞做空白对照组(CON组),绿色荧光蛋白腺病毒(EGFP-Ad)做空病毒对照组(EGFP-Ad组)。荧光检测到hTERT腺病毒感染成功。3.3、hTERT-Ad抑制髓核细胞的衰老转染hTERT-Ad后,不断传代,用普通光镜观察转染hTERT-Ad后髓核细胞的形态变大、胞质中颗粒增多、荧光减少；PCR方法检测到转染hTERT-Ad的髓核细胞中Ⅱ型胶原、hTERT基因表达比CON组和EGFP-Ad组高；WesternBlot检测到转染hTERT-Ad的髓核细胞中Ⅱ型胶原、hTERT蛋白表达比CON组和EGFP-Ad组高。阿尔辛蓝染色(alcian blue staining)检测到转染hTERT-Ad的髓核细胞中蛋白多糖含量比CON组(?)(?) EGFP-Ad组高,有显著性差异(p<0.05)。p-半乳糖苷酶活性染色(SA-β-gal)发现转染hTERT-Ad的髓核细胞中衰老细胞比例比CON组和EGFP-Ad组低,比较有显著性差异(p<0.05)。4、hTERT阻抑椎间盘退变的体内研究4.1、hTERT-Ad导入椎间盘内18只新西兰大白兔,设计每只实验兔的L5/6为注入0.1M的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)对照组(PBS组),L4/5为注入hTERT-Ad治疗组(hTERT-Ad组),L3/4为空白对照组(CON组)。分别在第1、3、6三个月处死试验兔并比较椎间盘之间的退变程度的差异。用构建退变模型的方法穿刺椎间盘,即用18G注射针头经皮穿刺进入椎间盘髓核,CT扫描确定针尖达到椎间盘髓核中央,反复穿刺3次。CON组不进行任何穿刺,PBS组穿刺后,用微量注射器向髓核中注入20μL无菌PBS液,hTERT-Ad治疗组,在穿刺后,用微量注射器向髓核中注入20μL hTERT-Ad液。术后麻醉清醒后,实验兔放入兔笼中饲养,术后每日注射青霉素钠20万U/Kg,连续注射3天。密切观察兔子生存情况。4.2、hTERT阻抑椎间盘退变的影像学检测分在1、3、6个月各取6只治疗的新西兰大白兔,应用速眠新和阿托品镇静,戊巴比妥钠静脉麻醉成功后,左侧卧位放在X线工作台上拍摄腰椎侧位片；在MRI工作台上,应用人体膝关节检测线圈检测新西兰大白兔腰椎和脊髓的T1加权像以及T2加权像。X线片保存后用Image J 1.37软件测量椎间隙高度变化,分别比较测量的椎间隙高度与术前椎间隙高度百分比。X线检查发现：第一个月,可以观察到PBS组椎间盘终板轻度硬化,但是CON、hTERT、PBS三组的椎间隙高度没有明显的差异,三组之间比较的P值均大于0.05。第三个月时发现PBS组的椎间隙高度明显比对照组下降,hTERT组与对照组比没有显著性差异；hTERT组和PBS组比有显著性差异(P<0.05)；PBS组终板开始明显出现硬化改变,而hTERT组椎间隙高度下降不明显,没有观察到终板硬化。到第六个月时,PBS组的椎间隙高度明显下降,椎间隙明显狭窄,而且终板明显硬化,椎体前缘看见骨赘形成；hTERT组椎间隙高度轻度下降,与对照组比没有显著性差异,但与PBS组比较有显著性差异(P<0.05)。hTERT组终板开始有轻度硬化的改变。在MRI片上用改良后的Thompson分级法评估椎间盘退变程度发现：hTERT组、PBS组的椎间盘信号随着时间点的延长逐渐下降,但是PBS组下降比hTERT组更明显,而且终板退变也更明显。4.3. hTERT阻抑椎间盘退变的大体观察分在1、3、6个月各取6只治疗的新西兰大白兔,应用速眠新和阿托品镇静,致死量戊巴比妥钠静脉注射处死。取出CON组、PBS组和hTERT-Ad组中的椎间盘组织,大体观察发现：hTERT组中的髓核有退变性改变,但比PBS组退变明显更缓慢,退变程度更轻,在注射hTERT-Ad后第六个月,髓核中央仍然有少量的髓核组织,纤维环轻度退变,比PBS组中第一个月的退变还更轻。4.4. hTERT阻抑椎间盘退变的病理学检测分在1、3、6个月各取6只治疗的新西兰大白兔,应用致死量戊巴比妥钠静脉注射处死。取出CON组、PBS组和hTERT-Ad组中的椎间盘组织,用4%甲醛固定,常规脱水、石蜡包埋、切片。切片进行HE染色和Ⅱ胶原免疫组织化学法染色。HE染色发现,第一月后,PBS组髓核内已经长入类软骨样细胞,细胞间成分紊乱排列,细胞外基质明显减少,明显已经退变,而hTERT组中的纤维环和髓核交界处呈分离状,髓核内脊索细胞减少,髓核内细胞间成分也出现分离现象。第三、六个月hTERT组髓核中的脊索细胞进一步减少,细胞间质成分减少,排列更紊乱,髓核和纤维环交界处结构更紊乱,明显还存在正常组织结构和成分,但是PBS组中的髓核与纤维环交界处继续发生结构紊乱,组织细胞进一步分化成类软骨样细胞,而且类软骨样细胞数量增多,退变明显比hTERT-Ad组更严重。免疫组化染色发现：第一个月：对照组和hTERT组中脊索细胞内的胞浆中含有丰富的Ⅱ型胶原,细胞外也表达Ⅱ型胶原强阳性,而PBS组中的细胞外Ⅱ型胶原表达明显减少,而且细胞为类软骨样细胞,虽然也有Ⅱ型胶原表达,但是表达量明显更少。随着观察时间增长,PBS组中的Ⅱ型胶原表达明显比对照组和hTERT组少,而hTERT组比对照组只稍微有所减少。4.5、hTERT阻抑椎间盘退变的分子生物学检测4.5.1椎间盘中Ⅱ型胶原蛋白的表达分别取出1、3、6个月新西兰大白兔CON组、PBS组和hTERT-Ad组中的椎间盘组织,用2×SDS裂解液提取椎间盘组织总蛋白,用Western Blot检测技术检测椎间盘组织内Ⅱ型胶原蛋白的表达。随着时间的增长,PBS组明显比hTERT组Ⅱ型胶原表达减少,而hTERT组与CON组虽有减少,但比PBS组减少的更慢。4.5.2椎间盘中蛋白多糖的表达分别取出1、3、6个月新西兰大白兔CON组、PBS组和hTERT-Ad组中的椎间盘组织。用木瓜蛋白酶消化法消化椎间盘组织,消化得到的液体用二甲基亚甲蓝染色的方法检测椎间盘组织中蛋白多糖的OD值变化,参考硫酸软骨素标准曲线计算出组织中蛋白多糖的含量。比较CON组、PBS组和hTERT-Ad组中的椎间盘组织内蛋白多糖含量的差异。结果发现在第一个月中,PBS组中蛋白多糖含量明显减少,CON组与hTERT组之间没有显著性差异(P>0.05),CON组与PBS组以及hTERT组与PBS组之间是有显著性差异的(P<0.05)。第三和第六个月时,PBS组中蛋白多糖含量明显进一步减少,hTERT组与PBS组比有显著性差异(P<0.05),hTERT组与CON组比没有差异(P>0.05)。论文小结：本研究的目的是探讨hTERT基因治疗对延缓椎间盘细胞衰老并进一步阻抑椎间盘退变的作用及其分子机制。采用分子克隆的方法构建hTERT基因腺病毒(hTERT-Ad);在CT定位引导下经皮穿刺构建兔椎间盘退变模型；采用体内和体外实验,通过腺病毒将hTERT基因导入椎间盘细胞内,在动物、细胞与分子水平检测hTERT基因延缓椎间盘细胞衰老并进一步阻抑椎间盘退变的作用。在分子水平,hTERT基因能够明显阻抑椎间盘退变组织和细胞中细胞外基质如蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量的减少；在细胞水平,hTERT基因能够显著性阻抑椎间盘细胞衰老以及衰老细胞的比例,阻抑椎间盘髓核细胞数量减少：在动物水平,hTERT基因能够阻抑椎间盘退变过程中椎间隙高度的下降以及MRI检测时椎间盘信号的下降,能够阻抑椎间盘退变时髓核细胞数量的下降以及类软骨样细胞分化的增多。综上所述,hTERT基因能够有效阻抑椎间盘细胞衰老以及椎间盘退变,而且是通过阻抑椎间盘组织和细胞中蛋白多糖以及Ⅱ型胶原的减少进而阻抑椎间盘退变。