背景:真核起始因子6(Eukaryotic initiation factor 6,e IF6)是一种在进化过程中的保守蛋白,e IF6通过调控核糖体40S和60S亚基的结合在核糖体合成及翻译调控中发挥重要作用。研究发现:(1)细胞核内e IF6是酵母和哺乳动物细胞60S核糖体亚基生物合成必须的;(2)细胞浆内e IF6是哺乳动物细胞胰岛素和生长因子刺激蛋白质翻译所必须的。e IF6在体外的表达具有看家基因的特征,而其在体内的表达是可变的。此外,e IF6还在快速增殖的细胞的高表达。其表达异常已被证实与一些病理状态相关,比如结直肠癌、头颈部肿瘤、恶性间皮细胞瘤。有文献报道称e IF6高表达会引起非洲爪蟾眼睛发育畸变。e IF6被认为是翻译起始的限速因子,可影响肿瘤发生及肿瘤生长。胞浆中e IF6活性受损可限制淋巴瘤生成及肿瘤进展。本课题组前期研究发现e IF6是神经元蛋白3.1(neuronal protein 3.1,又名P311)的相互作用蛋白,P311通过增加TGF-β1的表达促进增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)的形成和收缩。基因表达谱研究及比较蛋白质组学研究发现,P311蛋白是纤维化相关肌成纤维细胞中显著高表达的差异蛋白。肌成纤维细胞是几乎所有纤维化疾病发生的关键效应细胞,肌成纤维细胞通过合成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)及执行收缩力参与结缔组织重塑。肌成纤维细胞的特征是表达α肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),α-SMA是公认的标志肌成纤维细胞分化的关键因素及肌成纤维细胞产生收缩力的主要效应分子。大量研究证实前纤维化细胞因子TGF-β1和细胞外基质维持的机械力是目前诱导肌成纤维细胞分化和维持肌成纤维细胞持续存在不发生凋亡的最重要的因素。因此,根据前期研究基础及对文献分析,我们推测e IF6可能参与肌成纤维细胞的分化。目的:本研究的目的是探索e IF6是否能影响肌成纤维细胞细胞的分化?这种作用是否通过调控TGF-β1的表达实现?e IF6又是通过什么分子机制参与TGF-β1基因的表达调控?第一部分e IF6基因缺陷的杂合子小鼠皮肤肌成纤维细胞分离培养及鉴定方法:1.分离新生e IF6+/-杂合子小鼠及野生型小鼠(日龄3天内)真皮细胞进行原代培养(e IF6基因完全敲除的e IF6纯合子小鼠胚胎在着床前即是致死性的)。本课题实验中使用的是第1代至第3代的细胞。2.应用免疫细胞化学方法检测分离培养的真皮细胞中Vimentin及α-SMA的表达。3.应用逆转录PCR法对分离培养的真皮细胞进行基因型鉴定,区分来自e IF6+/-杂合子小鼠及野生型小鼠的细胞。4.应用Real-Time PCR及Western blotting技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中e IF6 m RNA及蛋白的表达。结果:1.我们成功分离培养了新生小鼠真皮肌成纤维细胞,细胞呈单层贴壁生长,呈典型的梭型及多角形形态,细胞体积较大。2.免疫细胞化学结果显示Vimentin及α-SMA在体外培养的新生小鼠真皮胞浆中呈强阳性表达,阳性细胞率为100%。3.逆转录PCR实验结果显示,PCR产物在琼脂糖凝胶电泳仅显示320bp一条带的是来自于野生型小鼠的样本,而显示650bp及320bp两条带的是来自于e IF6基因表达缺陷的杂合子小鼠的样本。4.Western blotting实验及Real-Time PCR实验结果进一步确证,与野生型小鼠真皮来源的肌成纤维细胞相比,e IF6 m RNA的表达在e IF6+/-杂合子小鼠的真皮肌成纤维细胞中降低了约40%,e IF6蛋白的表达在e IF6+/-杂合子小鼠的真皮肌成纤维细胞中降低了约60%。第二部分e IF6对皮肤肌成纤维细胞生物学特性及功能的影响方法:1.采用流式细胞技术检测体外培养的来源于野生型及e IF6+/-杂合子小鼠真皮肌成纤维细胞的细胞周期。2.采用TUNEL法比较来源于野生型及e IF6+/-杂合子小鼠真皮肌成纤维细胞细胞凋亡的情况。3.应用Real-Time PCR及Western blotting技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中α-SMA m RNA及蛋白的表达;应用Real-Time PCR技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中I型胶原m RNA的表达;应用罗丹明-标记鬼笔环肽染色e IF6+/-杂合子及野生型细胞中的应力纤维并用激光共聚焦显微镜观察应力纤维形成的情况;应用成纤维细胞凝胶收缩模型观察e IF6+/-杂合子及野生型细胞收缩胶原的能力。结果:1.采用流式细胞技术检测体外培养的肌成纤维细胞的细胞周期,结果显示:来源于e IF6基因缺陷杂合子小鼠的细胞处于S期的比例明显低于来源于野生型小鼠的细胞(e IF6+/-杂合子细胞处于S期的比例为6.92%,而野生型细胞的比例为11.16%)。然而e IF6+/-杂合子细胞处于G2/M期的比例为42.13%,显著高于野生型细胞(仅为27.59%)。2.TUNEL法比较来源于野生型及e IF6+/-杂合子小鼠真皮肌成纤维细胞细胞凋亡的情况,两组间凋亡细胞与有核细胞比例的差异无统计学意义3.较野生型细胞相比,α-SMA在e IF6+/-杂合子细胞中的表达在m RNA水平及蛋白水平均显著增高(m RNA表达增高2.9倍,P=0.020,n=5;蛋白表达增高1.8倍,P=0.029,n=5)。e IF6+/-杂合子细胞表达I型胶原(Col1a1and Col1a2)m RNA的量也明显高于野生型细胞中的表达量,Col1a1m RNA表达增高4.9倍(P=0.001,n=3),Col1a2m RNA表达增高4.6倍(P=0.007,n=3)。此外,激光共聚焦显微镜结果显示:与野生型细胞相比,e IF6+/-杂合子细胞中罗丹明-标记鬼笔环肽染色的应力纤维形成增加,排列分布得更加密集。分析胶原收缩能力的成纤维细胞凝胶收缩模型发现,e IF6+/-杂合子细胞收缩胶原的能力强于野生型细胞(P=0.001,n=3)。第三部分e IF6对皮肤肌成纤维细胞分化过程中信号转导的影响方法:1.应用Real-Time PCR及Western blotting技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中TGF-β1 m RNA及蛋白的表达。2.应用Real-Time PCR技术检测e IF6+/-杂合子及野生型细胞中TGF-β1 I型受体(Tgfbr1)及TGF-β1 II型受体(Tgfbr2)m RNA的表达;应用Western blotting技术检测在外源性TGF-β1刺激条件下,e IF6+/-杂合子及野生型细胞中Smad蛋白的表达。3.应用Western blotting技术检测在用SB431542阻断TGF-β/Smad信号通路后,e IF6+/-杂合子及野生型细胞中p-Smad2及α-SMA蛋白的表达。结果:1.Real-Time PCR实验结果显示,TGF-β1(Tgfb1)m RNA在e IF6+/-杂合子细胞中的表达显著高于其在野生型细胞中的表达量,Tgfb1m RNA表达增高2.7倍(P<0.001,n=5)。ELISA实验也发现e IF6+/-杂合子细胞分泌到培养上清中的TGF-β1也明显增高(增高1.8倍,P<0.001,n=5)。2.Real-Time PCR实验结果显示,Tgfbr1及Tgfbr2m RNA的表达在e IF6+/-杂合子细胞及野生型细胞中无显著差异(P=NS,n=3)。Western blotting实验结果显示:较野生型细胞相比,e IF6+/-杂合子细胞中p-Smad2蛋白的表达增高1.5倍(P=0.008,n=3),与此同时抑制性Smad7蛋白的表达量在e IF6+/-杂合子细胞中降低50%(P=0.002,n=3)。e IF6+/-杂合子细胞中p-Smad3蛋白的表达也增高了,但差异不具有统计学意义(P=NS,n=3)。3.Western blotting实验结果表明,SB431542处理可显著抑制e IF6+/-杂合子细胞中p-Smad2及α-SMA的增高,使其表达水平与在野生型细胞中表达量相当。第四部分e IF6通过影响TGF-β1转录调控皮肤肌成纤维细胞分化的机制探究方法:1.应用多核糖体谱实验技术检测TGF-β1 m RNA在野生型细胞组与e IF6+/-杂合子细胞中翻译效率。2.用放线菌素D(actinomycin D)预处理细胞旨在抑制细胞中新的m RNA的合成,并在处理后不同时间通过Real-Time PCR的方法检测细胞中原有m RNA随时间降解的情况,比较TGF-β1 m RNA在野生型细胞组与e IF6+/-杂合子细胞中m RNA稳定性差异。3.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)检测肌成纤维细胞中TGF-β1启动子区域甲基化程度。4.应用定量蛋白组学i TRAQ技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation)筛选野生型及e IF6基因表达缺陷的肌成纤维细胞中差异表达蛋白,并进行Western blotting实验验证。5.应用染色质免疫共沉淀(Ch IP)技术检测组蛋白变体H2A.Z和转录因子Sp1与TGF-β1基因启动子区域的结合情况,并用Real-Time PCR方法对相同处理条件下TGF-β1 m RNA表达进行检测。结果:1.多核糖体谱实验发现,在含有质量大的多聚核糖体的馏分中TGF-β1 m RNA的含量在野生型细胞组与e IF6+/-杂合子细胞组无显著差异。2.TGF-β1 m RNA在野生型细胞组与e IF6+/-杂合子细胞中的半衰期均为10.5h,两组间TGF-β1 m RNA稳定性并无差异。3.BSP实验结果显示:在野生型细胞组TGF-β1启动子甲基化比例为61.9%,在e IF6+/-杂合子细胞组TGF-β1启动子甲基化比例为73.8%,二者差异无统计学意义4.i TRAQ实验发现302个与e IF6表达缺陷相关的差异表达蛋白。Go分析发现,e IF6表达缺陷导致表达下调的差异蛋白与染色体染色质组装、染色质聚集解聚、DNA包装、蛋白-DNA复合物聚集以及核小体聚集密切相关。其中,e IF6表达缺陷导致一些组蛋白的表达显著降低。在这些差异表达的组蛋白中,变化程度最大的为Histone variant H2A.Z(表达下降50%,P=4.30×10-11<0.0001)以及Histone H2B(表达下降约40%,P=1.11×10-5<0.0001)。我们通过Western blotting实验对部分差异表达蛋白进行验证,结果发现,较野生型细胞相比,组蛋白H2B及组蛋白变体H2A.Z在e IF6+/-杂合子细胞中的表达显著降低,H2B蛋白表达降低了45%,H2A.Z蛋白降低了40%(P=0.051,n=3),该结果与定量蛋白质组学结果一致。此外,我还通过Real-Time PCR技术检测了e IF6+/-杂合子细胞中的H2A.Z(H2afz)m RNA的表达,H2afz m RNA表达较野生型细胞中降低了20%(P=0.015,n=3)5.Ch IP-q PCR实验结果显示,经外源性TGF-β1预处理的野生型细胞及e IF6+/-杂合子细胞,在e IF6+/-杂合子细胞中H2A.Z与TGF-β1启动子相应区域的结合较野生型细胞相比显著降低,而此时在野生型细胞中TGF-β1启动子相应区域有大量的H2A.Z蛋白的结合(相应结合区域为区域1:-120/+73;区域2:-37/+175;区域3:-118/+246)。此外,Ch IP-q PCR实验结果也显示:e IF6+/-杂合子细胞中Sp1结合TGF-β1启动子的量显著高于其在野生型细胞中的结合量,并且结合区域包含所有Sp1在TGF-β1启动子上的预期结合位点。与此同时,在外源性TGF-β1刺激的条件下TGF-β1诱导自身m RNA表达量在e IF6+/-杂合子细胞中显著增高,是野生型细胞表达量的3.4倍(P=0.001,n=5)。全文结论:总结本课题研究,可得出以下结论:1.e IF6参与调控肌成纤维细胞的分化,e IF6表达缺陷诱导肌成纤维细胞分化,促进肌成纤维细胞表达α-SMA、合成胶原及增强细胞收缩胶原的能力。2.e IF6负性调控肌成纤维细胞中TGF-β1的表达,并且该调控作用主要发生在转录层面。3.e IF6表达缺陷通过下调组蛋白变体H2A.Z对TGF-β1启动子的结合,可能通过增加染色质的空间可接近性,从而促进转录因子Sp1对TGF-β1启动子的结合,导致TGF-β1转录活性增强。4.TGF-β/Smad信号通路参与了e IF6介导的肌成纤维细胞活化及分化。因此,我们的研究发现了目前尚未有报道的e IF6分子新的生物学功能及调控机制,即e IF6通过调控TGF-β1的转录介导肌成纤维细胞的分化,本研究拓展了对e IF6这个重要分子的认识。此外,e IF6具有抑制肌成纤维细胞分化的功能,而肌成纤维细胞本身是创面修复和纤维化形成中的主要功能细胞,故该研究可能为今后创面修复和纤维化形成的研究提供新的线索。