背景:烷化剂环磷酰胺(cyclophosphamide , CP)虽已有研究证实其可致性腺损害,但至今在儿童的各类恶性肿瘤、自身免疫性疾病等中仍在广泛应用。临床回顾性和动物实验研究(包括本课题组前期研究)已证实,CP对男性生精功能具有明确的损伤作用[1-9]。但CP所致未成熟睾丸损伤的机理尚无公认的解释,也给寻找保护措施的研究带来了困难。既往的研究主要集中在CP抗肿瘤成分磷酰胺氮芥,并认为是其直接作用于生精干细胞而导致其凋亡坏死所致[3],近年研究发现,CP致睾丸氧化应激损伤并破坏其生精微环境可能是另一重要机理[10, 11]。CP是一种无活性的前体药物,在体内被细胞色素p450代谢后才具有抗肿瘤作用等生物活性[1]。而丙烯醛(Acrolein,ACR)是CP的主要代谢副产物,ACR对肝脏,肾脏,心脏等器官的毒性已有报告,最明确的是可导致出血性膀胱炎[12]。CYP3A4,CYP3A5是CP代谢产生ACR的关键酶,除了在肝脏和肾脏高表达外,在睾丸Sertoli细胞中也有较高表达[13]。同时ACR是一种强氧化剂,因此提示ACR不但可存在睾丸组织中,而且其氧化应激作用完全可导致未成熟睾丸的损害。已研究证实银杏叶中的有效成分—银杏黄酮具有良好的抗氧化作用[14],同时,银杏黄酮还可以抑制肿瘤细胞的增殖[15, 16],因而在CP化疗过程中辅以银杏黄酮有可能发挥保护性腺和抗肿瘤的双重作用。目的:通过建立CP损伤未成熟睾丸SD大鼠模型,探讨CP睾丸毒性与ACR的氧化应激损伤的相关性,及其作用可能的靶细胞,在此基础上分离培养未成熟SD大鼠睾丸的Sertoli细胞,进一步研究ACR对Sertoli细胞氧化应激损伤及银杏黄酮保护作用的机理,最后在体内探讨银杏黄酮对CP睾丸毒性的防护作用,为进一步临床应用奠定理论基础。方法:①建立未成熟SD大鼠CP化疗睾丸损伤模型,光镜及电镜技术观察睾丸组织细胞形态学改变、性激素检测、精子头计数等评估其生精功能改变。并通过体内实验,免疫组织化学法探讨CP睾丸损伤与ACR的相关性,以及可能靶细胞。同时检测睾丸组织抗氧化酶活性及氧化应激反应标志物的改变,研究CP化疗睾丸损伤与氧化应激反应的相关性,初步探讨体内CP氧化应激损伤的机理;②建立未成熟SD大鼠睾丸Sertoli细胞原代培养模型,鉴定细胞纯度,以ACR作为体外干预因素,研究ACR对Sertoli细胞体外毒性作用机理。光镜下直接观察细胞形态改变,免疫ICC研究ACR作用的靶点,分光光度法测定Sertoli细胞主要抗氧化酶及氧化应激反应标志物的改变,探讨体外ACR对Sertoli细胞损伤的可能机理;③在体外ACR对Sertoli细胞损伤的研究基础上,加用银杏叶标准提取物银杏黄酮作为干预因素,利用光镜技术观察细胞形态的改变,分光光度法测定Sertoli细胞主要抗氧化酶及氧化应激反应标志物的改变,半定量RT-PCR分析抗氧化相关酶的基因表达改变,探讨银杏黄酮体外对Sertoli细胞ACR所致的氧化应激损伤的保护作用及机制;④通过体内实验,未成熟SD大鼠银杏黄酮溶液连续灌胃1周后,予CP睾丸毒性化疗剂量化疗,光学显微镜电镜观察睾丸组织形态改变,急性期酶分析法测定睾丸内抗氧化物相关酶SOD和GR活性及总抗氧化能力,半定量RT-PCR分析抗氧化相关酶的基因表达改变,恢复期用精子头计数及血清性激素改变了解生精功能改变,探讨银杏黄酮在体内对CP所致未成熟毒性的保护作用。结果:1 CP腹腔注射后急性期(24h)大鼠睾丸损伤相关检测结果1) ACR抗原主要位于Sertoli细胞核内,ACR改变的蛋白质含量较对照组显著升高(P<0.05), Correlate相关分析提示ACR抗体阳性表达量与用药剂量呈正相关(r=0.763, P<0.05.)。2)抗氧化能力:各实验组T-AOC,GR和SOD活性与对照组相比均有显著性差异(P<0.05),Correlate相关分析提示,三个指标均与CP剂量呈负相关(r=-0.893,-0.934,-0.950;P<0.01);3)氧化应激反应标志:MDA和OH.,各实验组较对照组均有显著性差异(P<0.05),Correlate相关分析提示,两项指标均与CP剂量正相关(r=0.888,0.937;P<0.01)。2 CP腹腔注射后恢复期(4w)大鼠睾丸损伤相关检测结果1)睾丸指数(睾丸质量/体重):实验组较对照显著下降(P<0.05),且与CP剂量负相关(r=-0.779 P<0.01);2)组织学改变:实验组光镜下见睾丸组织形态有不同程度的损伤,损伤程度与CP剂量正相关;电镜下见Sertoli细胞线粒体、内质网损伤明显,提示CP主要损伤未成熟睾丸组织中的Sertoli细胞,但Leydig细胞未见明显结构异常。3)精子头部计数:各实验组与对照组的比较,均有显著降低(P<0.01),Correlate相关分析提示精子头部计数也与CP剂量呈负相关,其相关系数为-0.942,P=0.00。4)性激素:实验组ITT均较对照组显著增高(P<0.05),Correlate相关分析提示ITT与CP剂量正相关(r=0.893,P<0.01);实验组血清中FSH、LH较对照组显著升高(P<0.01),而同一时期实验组和对照组比较血清中T的水平,无统计学差异(P>0.05)。Correlate相关性分析提示,血清FSH和LH测量值与CP剂量正相关(r=0.865,0.850;P<0.05)。3原代培养未成熟SD大鼠的Sertoli细胞形态为:贴壁生长,不规则的多边形, Sertoli细胞约占培养细胞总量的90%以上,细胞的突起融合形成非常牢固的细胞间连接,界限不清。胞核清晰可见,有2-4个核仁。鉴定活细胞率为92%-95%,其纯度达95%(P<0.05)。4 ACR孵育3h和12h后Sertoli细胞损伤检测结果1) MTT:除10μM组外,其余各组细胞活力与阴性对照组均有显著性差异(P<0.05),CD50分别为200和105μM。2) ICC:各实验组ACR-Pro表达量较对照组均有显著升高(P<0.05)不同剂量和作用时间组之间两两比较也有显著性差异(P<0.05),阳性表达主要位于细胞核内。3)氧化应激反应标志:实验组MDA和OH.含量较正常对照组显著增高(P<0.05),MDA和OH.的含量与ACR的剂量和作用时间正相关(P<0.05)。4)抗氧化能力:实验组T-AOC,SOD和GR活性均较正常对照组显著降低(P<0.05),且三个指标与ACR剂量和作用时间负相关(P<0.05)。5银杏黄酮在体外对接触ACR的Sertoli细胞的保护作用1)光镜下连续动态观察发现,预加银杏黄酮和Vit E组,细胞暴露于ACR后,形态无明显改变;银杏黄酮和ACR同时添加组、银杏黄酮与ACR共孵育后加入细胞组与阴性对照组比较无明显差异。2) MTT:银杏黄酮和ACR同时添加组、银杏黄酮与ACR共孵育后加入细胞组细胞活性与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)。预加银杏黄酮和Vit E组细胞活性均较阴性对照组显著升高(P<0.05),但银杏黄酮的作用明显强于Vit E(P<0.05)。3) ICC检测ACR-Pro结果:银杏黄酮与ACR同时添加组、银杏黄酮与ACR共孵育后加入细胞组与阴性对照组比较无显著差异(P >0.05)。预加银杏黄酮和Vit E组细胞均较阴性对照组显著升高(P<0.05),但银杏黄酮的作用明显强于Vit E(P<0.05)。4)抗氧化能力:T-AOC,SOD和GR活性测试结果,银杏黄酮和ACR同时添加组、银杏黄酮与ACR共孵育后加入细胞组与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)。预加银杏黄酮和Vit E组均较阴性对照组显著升高(P<0.05),但银杏黄酮的作用明显强于Vit E(P<0.05)。5)氧化应激反应标志:各组细胞的MDA、OH.测试结果,银杏黄酮和ACR同时添加组、银杏黄酮与ACR共孵育后加入细胞组与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)。预加银杏黄酮和Vit E组细均较阴性对照组显著降低(P<0.05),但银杏黄酮的作用明显强于Vit E(P<0.05)。6)抗氧化酶基因表达:各组细胞的Cu-Zn SOD、GPx的mRNA测试结果,银杏黄酮和ACR同时添加组、银杏黄酮与ACR共孵育后加入细胞组与阴性对照组比较无显著差异(P>0.05)。预加银杏黄酮和Vit E组均较阴性对照组显著升高(P<0.05),但银杏黄酮的作用明显强于Vit E(P<0.05)6体内验证银杏黄酮对接触CP致幼鼠睾丸毒性的保护作用1)急性期(24h):银杏黄酮显著降低CP化疗后急性期睾丸组织内的MDA和OH.含量显著降低(P<0.05),显著升高T-AOC,GR和SOD活性(P<0.05);显著提高CP化疗后急性期睾丸组织内的Mn SOD、Cu-Zn SOD及GPx的mRNA表达量(P<0.05);免疫组织化学检测,银杏黄酮显著降低CP化疗后急性期睾丸组织内ACR抗体的表达。2)恢复期(4w):预先银杏黄酮灌胃的CP化疗大鼠睾丸指数与正常对照无显著性差异(P>0.05),而与单独CP化疗组相比显著增加(P<0.05)。常规组织学检查,预先银杏黄酮灌胃的CP化疗大鼠恢复期曲细精管结构完整,Sertoli细胞、精原细胞无明显损伤。电镜检查超微结构,预先灌胃组支持结构完整,细胞线粒体结构基本正常。银杏黄酮预先灌胃大鼠用CP后4w时精子头计数较化疗对照组显著增加(P<0.05)。预先银杏黄酮灌胃的大鼠,CP化疗恢复期血清中FSH、LH以及ITT的浓度较正常对照组无显著性差异(P>0.05)。结论:1 CP在体内可以致睾丸组织氧化抗氧化平衡破坏,即抗氧化能力降低,氧自由基堆积,其主要毒性因子是其代谢产物ACR,且作用的靶细胞主要是Sertoli细胞。2 ACR在体外可以明显降低Sertoli细胞抗氧化能力,细胞氧化应激反应增强,清除自由基能力降低,细胞活力降低。3在体外银杏黄酮可提高Sertoli细胞在受到ACR氧化损伤时的抗氧化能力,并清除氧自由基,使细胞免受损伤。4银杏黄酮在体内可明显减轻CP对未成熟睾丸所致的氧化应激损伤,并使成年后具有正常的生精功能,为进一步的临床应用奠定了理论基础。