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目的:肿瘤细胞抵抗化疗药物的作用机理比较复杂,是多种相关基因联合表达,通过细胞不同水平层次调控的复杂生物学过程,一般涉及到细胞膜上表达的耐药蛋白介导化疗药物外排、细胞内凋亡水平降低和抗凋亡水平升高、细胞增殖周期调控改变等方面。核仁素作为细胞代谢过程中的重要的多功能蛋白,具有调节染色体复制、参与核糖体形成及RNA转录、调节某些m RNA的翻译以及特定micro RNA形成等功能。本课题通过研究核仁素（Nucleolin、NCL、C23）在CA46细胞上的表达,探讨核仁素在CA46细胞药物耐受方面的作用机制。方法:1、通过慢病毒介导的转染方式,建立RNAi沉默核仁素的CA46细胞株（CA46-C23-knockdown,CA46-C23-KD）以及核仁素过表达的CA46细胞株（CA46-C23-overexpression,CA46-C23-OE）这两种NCL表达差异的细胞模型,同时,通过长期的低浓度阿霉素的培养诱导,建立多药耐药细胞株CA46/ADR。2、采用细胞增殖法（MTS法）分别检测CA46-C23-KD、CA46-C23-OE和CA46/ADR三种NCL差异性表达的细胞模型对阿霉素的增殖半数抑制率（IC50）。3、通过放线菌素D实验检测CA46-C23-KD、CA46-C23-OE细胞株中BCL-2m RNA的稳定性变化,用RNA-蛋白质免疫共沉淀法（RIP）在CA46细胞上研究NCL与BCL-2 m RNA的相互作用。4、采用流式细胞周期分析术检测CA46-C23-KD周期表达,蛋白免疫印迹法检测CA46-C23-KD、CA46-C23-OE细胞株中cyclin D3、cyclin E1的表达,蛋白质免疫共沉淀技术（CO-IP）研究C23与cyclin D3、cyclin E1之间的相互作用。5、采用蛋白质免疫共沉淀和RNA-蛋白质免疫共沉淀法研究NCL对多药耐药蛋白P-gp以及其基因MDR1 m RNA的相互作用机制。6、采用实时荧光PCR技术检测CA46-C23-KD、CA46-C23-OE和CA46/ADR三种细胞模型中micro RNA-221的表达差异变化。RIP检测C23与pri-mi RNA-221的相互作用。结果:1、与阴性对照组CA46-C23-KNC（CA46-C23-knockdown negative control）相比,CA46-C23-KD中NCL m RNA和C23蛋白表达下调。与阴性对照组CA46-C23-ONC（CA46-C23-overexpression negative control）相比,CA46-C23-OE中NCL m RNA和C23蛋白表达明显上调,CA46/ADR细胞株中多药耐药蛋白P-gp和C23蛋白表达均出现上调。2、CA46-C23-KD细胞株对阿霉素的IC50为0.147±0.02μg/ml,明显低于对照组0.301±0.04μg/ml（p<0.05）。而CA46-C23-OE细胞株的阿霉素的IC50为0.679±0.06μg/ml,明显高于其对照0.383±0.08μg/ml（p<0.05）。CA46/ADR对阿霉素的IC50为1.874±0.13μg/ml,而CA46对阿霉素的IC50为0.215±0.05μg/ml。3、CA46-C23-KD中BCL-2m RNA稳定性低于CA46-C23-KNC,BCL-2m RNA的半衰期由4.8±0.15小时缩短至3.2±0.18小时,CA46-C23-OE中BCL-2m RNA稳定性明显高于CA46-C23-ONC,BCL-2 m RNA的半衰期由5.2±0.21小时延长到6.9±0.13小时。RIP实验显示C23蛋白能直接结合BCL-2 m RNA。4、与CA46-C23-KNC相比,CA46-C23-KD的G0/G1期比例增大,S期比例减少且cyclin D3表达升高,cyclin E1表达降低。与CA46-C23-ONC相比,CA46-C23-OE中cyclin E1表达升高。同时,CO-IP显示C23蛋白与cyclin D3、cyclin E1能直接结合。5、在CA46/ADR细胞中,NCL与P-gp表达均升高,但免疫共沉淀实验显示C23蛋白与P-gp蛋白无直接的相互作用,通过蛋白质-RNA共沉淀也未能证实C23蛋白与MDR1 m RNA能直接结合。6、micro RNA-221在NCL过表达的CA46细胞株和CA46/ADR细胞株中表达升高,而在NCL沉默的细胞株中表达下降。RIP实验显示C23蛋白能直接结合pri-mi RNA-221。结论:1、C23蛋白与BCL-2m RNA相互结合,通过增加BCL-2m RNA的稳定性来增加BCL-2m RNA转录,从而增加CA46细胞中BCL-2蛋白的表达,通过BCL-2的抗凋亡机制参与针对阿霉素的抵抗作用。2、C23蛋白与cyclin D3、cyclin E1直接结合,通过调节cyclin D3、cyclin E1的表达,加快S期进程来抵抗阿霉素对CA46细胞的作用。3、C23蛋白与MDR1/P-gp之间有正相关性,但CO-IP和RIP实验未能发现C23蛋白与P-gp蛋白或MDR1 m RNA能直接结合。4、C23蛋白通过直接结合pri-mi RNA-221来调控micro RNA-221的表达,从而通过调控其靶基因的表达抵抗药物的作用。