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随着测序技术的快速发展,越来越多的微生物基因组得以揭示。通过生物信息学分析发现,微生物基因组中蕴含着丰富的次级代谢产物生物合成基因簇。为了深度挖掘这些次级代谢产物的生物合成基因簇以满足日益增长的药物需求,本研究开发了一套高通量的细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosome,BAC）文库异源表达和生物活性筛选系统（Library EXpression and Analysis System,LEXAS）。利用链霉菌-细菌穿梭载体构建的细菌人工染色体文库,通过三亲本接合转移的方法在接合转移辅助菌株Escherichia coli ET12567/p UB307的帮助下,可以高通量地接合转移至异源表达宿主变铅青链霉菌SBT5中进行表达。然后通过高通量微孔发酵与指示菌覆盖生物活性测定,便可以实现异源表达文库的高通量活性筛选以获得新的活性次级代谢产物。在本研究中利用LEXAS对娄彻氏链霉菌Sal35的BAC文库进行筛选后,获得了5个编码活性次级代谢产物合成的基因簇,编码的代谢产物分别为:疏螺体素（Contig1,I型聚酮）、链丝菌素（Contig2,肽核苷）、线型脂肽8D1-1/2（Contig3,非核糖体肽）、Lexapeptide（Contig4,羊毛硫肽）以及一个可能的三型羊毛硫肽（Contig5,羊毛硫肽）。其中8D1-1/2与Lexapeptide为本研究中发现的新化合物,且Contig3-5携带的基因簇在娄彻栻链霉菌Sal35中是沉默的,在本研究中利用LEXAS的筛选方法激活了这3个基因簇的表达。本研究表明LEXAS可以高效地激活链霉菌中沉默次级代谢产物生物合成基因簇的表达,并能够实现对不同种类的活性代谢产物的表达,非常适用于链霉菌的功能基因组挖掘。LEXAS筛选获得的化合物Lexapeptide是一个新型高度修饰的羊毛硫肽,由38个氨基酸结构单元构成。其结构上的后修饰包括氨基端（N,N）-二甲基苯丙氨酸;第2、18及19位脱氢丙氨酸;第4与12位脱氢丁氨酸;Cys22与Abu33之间形成的甲基羊毛硫氨酸;28位D-Ala以及Cys38与Abu30之间形成的S-[（Z）-2-氨烯基]-（3S）-3-甲基-D-半胱氨酸。这些结构后修饰赋予了Lexapeptide优异的生物活性与结构稳定性。通过测序与大片段基因敲除实验,本研究获得了包含Lexapeptide最小生物合成基因簇的质粒p JLXM,携带22,984 bp的外源片段序列,编码了21个开放阅读框。经进一步的单基因敲除与代谢谱分析,确定了lxm A、lxm D、lxm W、lxm Y、lxm Z、lxm P1、lxm P2、lxm M、lxm J、lxm T、lxm R1、lxm R2以及lxm R3是Lexapeptide合成所必需的基因。其中lxm A编码Lexapeptide前体肽蛋白Lxm A;lxm D编码的半胱氨酸脱羧酶Lxm D可能催化Lxm A羧基末端Cys的脱羧氧化;lxm M编码的SAM依赖甲基转移酶Lxm M催化Lexapeptide氨基端苯丙氨酸氨基上的甲基化;lxm J编码的F420依赖还原酶Lxm J催化28位脱氢丙氨酸的还原生成D-Ala。Lxm J蛋白与传统的催化羊毛硫肽中D-Ala或D-Abu修饰的Lan JA与Lan JB蛋白属于不同家族蛋白,Lxm J单独构成了第三类催化羊毛硫肽中D-Ala修饰的蛋白,在本研究中以Lan JC表示。为了研究Lxm JC的催化机制,本研究以Lexapeptide Z为底物在体外重构了Lxm JC催化的反应。通过体外生化与体内点突变研究发现,Lxm JC只能以F420H2为辅因子特异性地催化Lexapeptide中环状结构内部Dha28的还原,而不能催化Dhb或Lexapeptide线性结构上Dha的还原。本研究在Lexapeptide生物合成基因簇中没有发现羊毛硫肽中常见的负责脱水与环化的Lan B、Lan C、Lan M、Lan KC以及Lan L蛋白的同源蛋白编码基因。结合生物信息学分析与敲除实验的结果,本研究推测Lxm WYZ三个蛋白可能参与催化Ser与Thr的脱水以及Cys与Dhb之间的环化反应。为了区别于Class I-IV家族羊毛硫肽,参考羊毛硫肽的分类准则,本研究将Lexapeptide归为Class V家族羊毛硫肽。利用Lxm Y蛋白的氨基酸序列对NCBI数据库中的序列进行检索后,发现了一系列新的Class V家族羊毛硫肽。本研究第一次发现并报到了Class V家族羊毛硫肽,并以Lexapeptide为实例对Class V家族羊毛硫肽的生物合成进行了初步的研究,为后续Class V家族羊毛硫肽的生物合成研究奠定了基础。同时Class V家族羊毛硫肽的发现也丰富了羊毛硫肽家族的成员,并发现了一系列新颖的催化羊毛硫肽后修饰的蛋白酶,为羊毛硫肽的后修饰改造提供了更为丰富的工具酶。本研究还获得了一系列活性优异的Lexapeptide衍生物,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌与耐甲氧西林表皮葡萄球菌均显示很好的抑菌活性,为抗菌药制剂的研发提供了新的前体。